羅 婠，熊 輝，韓 露，馬 培，周 新

（武漢大學(xué)中南醫(yī)院基因診斷中心，湖北武漢430071）

miR－222在急性心肌梗死診斷的意義

羅 婠，熊 輝，韓 露，馬 培，周 新＊

（武漢大學(xué)中南醫(yī)院基因診斷中心，湖北武漢430071）

目的研究血漿miR－222在急性心肌梗死患者中的表達(dá)水平變化。方法 收集患者發(fā)生急性心肌梗死后24小時(shí)內(nèi)的全血，分離血漿提取總RNA，莖環(huán)法特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以RNU6為內(nèi)參基因，采用real－time qPCR方法檢測(cè)49例急性心肌梗死患者和31例健康對(duì)照者血漿中miR－222的表達(dá)水平。結(jié)果 miR－222在心梗組中的表達(dá)量為0.766（0.184，2.463），對(duì)照組表達(dá)量為0.149（0.027，0.213），采用非參數(shù)Mann Whitney U檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯示，急性心肌梗死組miR－222表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（U＝291，P＜0.01）。ROC曲線下面積（AUC）為0.808（95%CI 0.714－0.913），miR－222診斷AMI的靈敏度和特異度分別為65.0%和93.5%。結(jié)論 急性心肌梗死患者血漿miR－222在心梗發(fā)生后24小時(shí)內(nèi)表達(dá)量顯著升高，miR－222可能對(duì)于急性心肌梗死的診斷具有一定價(jià)值。

急性心肌梗死；血漿；微小RNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1664）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是臨床最常見的最嚴(yán)重的急性心肌缺血性疾病，發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率高于我國，但隨著社會(huì)的發(fā)展，人口老齡化、生活方式及飲食習(xí)慣的變化使得我國的AMI發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)［1－3］。血漿中肌紅蛋白、肌鈣蛋白（cTn）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK－MB）檢測(cè)為診斷AMI的金標(biāo)準(zhǔn)。近年來，隨著國內(nèi)外對(duì)于miRNA研究得深入，其在各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中逐漸被人們所知。在心血管系統(tǒng)，miRNA已被證明在內(nèi)皮功能障礙、細(xì)胞凋亡、血管生成等病理生理?xiàng)l件下有重要的作用［4，5］，臺(tái)灣有學(xué)者［6］研究發(fā)現(xiàn)與心肌損傷等病理過程相關(guān)的miRNA也能作為診斷急性心肌梗死的生物標(biāo)志物，本研究通過觀察急性心肌梗死患者血漿miR－222水平的變化，探討其在AMI診斷中的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 2014年3－8月在武漢大學(xué)中南醫(yī)院心血管內(nèi)科收治的急性心肌梗死49例，男患者32例，女患者17例，年齡（64±12）歲，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管分會(huì)《急性心肌梗死診斷和治療指南》標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組31例，來自武漢大學(xué)中南醫(yī)院同期體檢健康者，男20例，女11例，年齡（64±7）歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血漿總RNA的提取 病例組患者在典型胸痛24h內(nèi)并在治療前，正常對(duì)照者在空腹8h后，采集外周靜脈血，EDTA－Na2抗凝。1小時(shí)內(nèi)（室溫或4℃放置）12 000g，離心8min，分離血漿后采用QIAGEN公司miRNeasy Serum／Plasma Kit試劑盒提取總RNA，Nano drop 2000c分光光度儀檢測(cè)RNA濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用TAKARA公司PrimeScript RT reagent KIT試劑盒，莖環(huán)法特異性逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，miR－222和RNU6的逆轉(zhuǎn)錄引物序列分別為：GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCAGTA和CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。反應(yīng)體系：2μl 5xPrimeScript Buffer，0.5μl PrimeScript RT Enzyme Mix，0.5μl特異性引物（20μM），2μl Total RNA，5μl RNase－Free Water。程序設(shè)置為：42℃15min，85℃5s。反應(yīng)完成后cDNA－20℃冰箱保存。

1.2.2 miRNAs的克隆驗(yàn)證測(cè)序 擴(kuò)增普通PCR并經(jīng)電泳鑒定目的片段。用AXYGEN公司PCR Cleanup Kit試劑盒純化回收普通PCR產(chǎn)物，TAKARA公司pMD－19T載體連接純化產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化克隆后交由上海睿迪公司測(cè)序驗(yàn)證擴(kuò)增片段是否正確。PCR擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 miR－222及RNU6擴(kuò)增引物序列

1.2.3 Real－time qPCR檢測(cè) 將miR－222和RNU6質(zhì)粒倍比稀釋成6個(gè)不同濃度，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以觀察引物擴(kuò)增效率。PCR試劑SYBR Premix Ex Taq II TM購于TAKARA公司。反應(yīng)體系：10μl 2xSYBR Premix Ex TaqTM II；1μl特異性上游引物；2μl Universal Primer；6μl RNase－Free Water。程序依次如下：95℃30秒；3步循環(huán)—95℃5秒，55℃30秒，72℃30秒，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 Real－time qPCR結(jié)果采用相對(duì)定量（2－ΔCt）方法進(jìn)行分析。計(jì)算每個(gè)樣本三個(gè)復(fù)孔的Ct值均值作為實(shí)際樣本Ct值，減去同一樣本內(nèi)參的Ct值均值，得到ΔCt值，再求得2－ΔCt值。運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，正態(tài)資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)資料用中位數(shù)（四分位數(shù)區(qū)間）表示，采用非參數(shù)Mann Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。受試者工作曲線（ROC曲線）判斷血漿miR－222診斷的靈敏度和特異度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 克隆測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 普通PCR擴(kuò)增目的片段，轉(zhuǎn)化克隆后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)顯示擴(kuò)增片段miR－222及RNU6序列均正確。2.2 引物擴(kuò)增效率驗(yàn)證 可接受的有效的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（sloop）應(yīng)在－3～－3.5之間，相關(guān)系數(shù)（R2）應(yīng)大于0.98，PCR擴(kuò)增效率（E）在90%－110%之間。所有目標(biāo)片段的擴(kuò)增均符合以上要求。說明運(yùn)用熒光定量PCR反應(yīng)檢測(cè)目的RNA表達(dá)水平是穩(wěn)定可靠的。

2.3 熒光定量PCR擴(kuò)增曲線 本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR方法測(cè)定miRNA表達(dá)水平，Ct值小于35認(rèn)為是有效擴(kuò)增，本研究Ct值均在27－35之間，結(jié)果合理可信。

2.4 miR－222表達(dá)水平 分析49例AMI患者與31例對(duì)照者血漿miR－222相對(duì)表達(dá)量，心梗組為0.7658（0.1838，2.4628），對(duì)照組表達(dá)量為0.1492（0.0265，0.2132），急性心肌梗死組血漿miR－222表達(dá)量顯著升高（U＝291，P＜0.01），且心梗組miR－222含量比對(duì)照組高出4倍左右。見表2。

表2 心梗組與對(duì)照組miR－222相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 ROC曲線 以miR－222相對(duì)表達(dá)量繪制ROC曲線，曲線下面積（AUC）為0.808，miR－222對(duì)于AMI的診斷靈敏度和特異度分別為65%和93.5%。miR－222診斷AMI有較高價(jià)值。見圖1。

圖1 MiR－222診斷AMI的ROC曲線

3 討論

自1993年第一次發(fā)現(xiàn)miRNAs以來，估計(jì)基因組中大概存在2000多種miRNAs，調(diào)控60%以上的蛋白編碼基因［7］。miRNAs的異常升高或降低可引起多種疾?。?］。

很多研究已經(jīng)觀察到miRNA在急性心肌梗死的患者血清／血漿中可發(fā)生變化，Wang等［9］發(fā)現(xiàn)在AMI患者血漿miR－1、miR－133a、miR－499和miR－208a的表達(dá)水平均明顯高于正常人和非AMI患者。今年國內(nèi)有研究者發(fā)現(xiàn)血漿miR133、miR－1291和miR－663b在AMI患者中明顯高于非AMI患者［10］，且ROC Curve分析顯示，miR133、miR－1291和miR－663b均具有較高的診斷特異性和敏感性；該研究并發(fā)現(xiàn)ST段抬高心肌梗死（STEMI）患者術(shù)后這三種miRNA水平均有不同程度的下調(diào)。He［11］等在359例AMI患者中血漿樣本中檢測(cè)了miR－328和miR－124的表達(dá)水平，并進(jìn)行了生存分析，結(jié)果表明miR－328和miR－124的表達(dá)水平顯著升高，且由于miRNA表達(dá)水平升高導(dǎo)致患者發(fā)生心衰或死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加。

此前已有報(bào)道證實(shí)miR－222參與多種炎癥反應(yīng)，并在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要的角色。其中有學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)糖尿病和高脂血癥誘發(fā)的炎性反應(yīng)可以通過選擇性下調(diào)miR－222的水平，以此上調(diào)間隙連接蛋白Cx43和Rho激酶的表達(dá)，從而刺激血管收縮［12］。通過對(duì)miR－222靶基因的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR－222調(diào)控包括細(xì)胞周期蛋白在內(nèi)的多種基因，推測(cè)miR－222有可能通過影響心肌細(xì)胞活動(dòng)和血管反應(yīng)參與到心血管疾病中。本研究發(fā)現(xiàn)血漿miR－222表達(dá)水平在AMI患者發(fā)作24小時(shí)內(nèi)明顯升高（U＝291，P＜0.01），ROC曲線下面積為0.808，說明miR－222對(duì)于AMI的診斷具有較高的價(jià)值；靈敏度和特異度分別為65%和93.5%，具有較高特異度。

在臨床上將miRNA的表達(dá)和現(xiàn)有的心梗標(biāo)志物肌紅蛋白、肌鈣蛋白（cTn）、肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK－MB）等聯(lián)合，可能為急性心肌梗死的診斷提供一條新的途徑。多種miRNAs表達(dá)譜的變化可能會(huì)更加靈敏診斷甚至早期預(yù)判心梗的發(fā)生。

［1］蘇 懿，王 磊，張敏州.急性心肌梗死的流行病學(xué)研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012（04）：467.

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Association of Plasma miR－222 Expression Level with Acute Myocardial Infarction

LUO Wan，XIONG Hui，HAN Lu，et al.
（Center for Gene Dignosis，Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan 430071，China）

ObjectiveTo evaluate the plasma miR－222expression level as a diagnostic biomarker for acute myocardial infarction（AMI）.Methods The patients’blood was collected after AMI occurred in 24hours，Total RNA was extracted from separated plasma，stem－loop method was used to reverse transcript cDNA.RNU6as reference gene.The relative expression levels of plasma miR－222in 49AMI patients and 31health control were measured by real－time qPCR.Results The expression level of miR－222was significantly increased in AMI［0.766（0.184，2.463）］than health group［0.149（0.027，0.213）］（U＝291，P＜0.01）.The sensitivity and specificity of miR－222for diagnosing AMI were 65.0%and 93.5%respectively.The AUC（area under the curve）of ROC curve was 0.808（95%confidence interval 0.714－0.913）.Conclusion Plasma miR－222was up－regulated in AMI group，which may serve as a potential diagnostic biomarker for AMI.

acute myocardial infarction；plasma；miRNA；real－time qPCR

R542.2＋2

A

羅婠（1990－），女，碩士研究生，研究方向：重大疾病的分子診斷；周新，教授，博士生導(dǎo)師。

2014－12－30）

1007－4287（2015）10－1664－03

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2012CB720600）

＊通訊作者