孫志惠，劉 鵬

（天津市第五中心醫(yī)院1.兒內(nèi)科；2.檢驗(yàn)科，天津300450）

EB病毒血清學(xué)及DNA聯(lián)合檢測(cè)在嬰幼兒傳染性單核細(xì)胞增多癥臨床應(yīng)用研究

孫志惠1，劉 鵬2

（天津市第五中心醫(yī)院1.兒內(nèi)科；2.檢驗(yàn)科，天津300450）

目的探討實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)傳染性單核細(xì)胞增多癥嬰兒的診斷價(jià)值。方法 選取臨床表現(xiàn)為發(fā)熱的嬰兒442例，其中48例傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒為觀察組，另選擇50例健康兒童為對(duì)照組，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（RT－qPCR）檢測(cè)外周血EB病毒DNA載體，對(duì)患兒進(jìn)行外周血異型淋巴細(xì)胞及血清嗜異凝集反應(yīng)，并對(duì)單個(gè)細(xì)胞EBV－DNA載量進(jìn)行檢測(cè)，全面對(duì)比分析EBV－DNA診斷的診斷效果。結(jié)果 ①EBV－DNA陽性患兒中異型淋巴細(xì)胞＞10%患兒39例，占69.6%，血清嗜異凝集反應(yīng)陽性患兒37例，占66.1%；EBV－DNA陰性患兒中異型淋巴細(xì)胞＞10%患者9例，占2.3%，血清嗜異凝集反應(yīng)陽性患者7例，占1.8%，兩組患者異型淋巴細(xì)胞＞10%患者及血清嗜異凝集反應(yīng)陽性患者占比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；②VCA－IgM陽性率最高，陽性率為87.5%（43／48），明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。結(jié)論 VCA－IgM與DNA聯(lián)合檢測(cè)能提高嬰幼兒傳染性單核細(xì)胞增多癥診斷準(zhǔn)確性。

單核細(xì)胞增多癥；實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)；異型淋巴細(xì)胞；載量

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1696）

傳染性單核細(xì)胞增多癥（IM）是一種由EB病毒引起的急性、亞急性單核－巨噬細(xì)胞急性增多性疾?。?］。該疾病好發(fā)于兒童，特別是嬰幼兒，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、咽峽炎以及肝脾腫大，并伴有血液中異常的淋巴細(xì)胞增高。由于此疾病臨床表現(xiàn)缺乏特異性，加之許多嬰幼兒往往只表現(xiàn)為上呼吸道感染癥狀，故往往容易誤診［2］。目前臨床上對(duì)此類病患診斷主要靠實(shí)驗(yàn)室手段對(duì)疑似傳染性單核細(xì)胞增多癥的嬰幼兒外周血進(jìn)行EB病毒感染血清學(xué)檢查，但是由于嬰幼兒身體免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完善，此單一方式同樣也會(huì)造成漏診。本研究選取EB病毒血清學(xué)及DNA聯(lián)合檢測(cè)手段，以探討其診斷效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)關(guān)于發(fā)熱、傳染性單核細(xì)胞增多癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］；年齡≤3歲；此前未經(jīng)藥物治療；排除惡性腫瘤、先天畸形、嚴(yán)重臟器功能不全者；排除臨床資料不完整及不能配合研究者。

選取2012.7－2014.7在我院進(jìn)行住院治療的發(fā)熱患兒442例，包括男241例，女201例，年齡3個(gè)月－3歲，平均（14.7±8.2）個(gè)月。其中經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)室診斷最終確診為傳染性單核細(xì)胞增多癥患兒48例，占10.9%，包括男26例，女22例，年齡3個(gè)月－2.5歲，平均年齡（14.2±7.8）個(gè)月。其余診斷為：上呼吸道感染212例，占48%；（支氣管炎）肺炎107例，占24.2%；（肺炎）支氣管炎65例，占14.7%，其他共10例，包括支原體感染5例，腎小球腎炎3例，病毒性心肌炎2例。

另選取健康查體患兒50例作為對(duì)照組，其中男26例，女24例，年齡3個(gè)月－3歲，平均（15.2±8.7）個(gè)月。兩組患者性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并均簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法 EBV－DNA載量檢測(cè)選取實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（RT－qPCR），具體操作為：先抽取患兒靜脈血3ml置于枸櫞酸鈉抗凝管中，應(yīng)用TaqMan熒光標(biāo)記探針基因擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，探針序列為FPEBV5’－XC－CTCGGA－CAGCTCCTAAGAAGGCACC－Y－3’，26bp。引物序列為：PQEBVF5’－AAGCCCAA－CACTCCAC－CAC－3’，19bp；PQEBVR5’－CTGGTAGGACT－GGGCGAC－3’，18bp。PCR擴(kuò)增條件：將各反應(yīng)管放入PE5700PCR儀，按下列條件擴(kuò)增：在93℃環(huán)境下進(jìn)行預(yù)變性2min后，再在93℃環(huán)境變性45s后轉(zhuǎn)入55℃環(huán)境下變性60s，往復(fù)10個(gè)循環(huán)，最后在93℃環(huán)境變性30s后轉(zhuǎn)入55℃下變性45s，往復(fù)30個(gè)循環(huán)。試劑購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，具體操作按說明書進(jìn)行。異常淋巴細(xì)胞比率指標(biāo)檢測(cè)采用患兒手指血，用推片進(jìn)行端氏染色，在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)異常淋巴細(xì)胞；血清嗜異凝集反應(yīng)采取靜脈血2ml置于收集管中，采用嗜異性凝集試劑盒（美國(guó)ARLINGTONSCIENTIFIC，INC生產(chǎn)，產(chǎn)品編號(hào)：950－0423－00）進(jìn)行血清嗜異凝集反應(yīng)檢測(cè)，以1：160為界限定義陽性和陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)值采用率或者百分比表示，率比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBV－DNA陽性患兒與陰性患兒異型淋巴細(xì)胞與血清嗜異凝集反應(yīng)比較 EBV－DNA陽性患兒56例，其中異型淋巴細(xì)胞＞10%患兒39例，占69.6%，血清嗜異凝集反應(yīng)陽性患兒37例，占66.1%；EBV－DNA陰性患兒386例，其中異型淋巴細(xì)胞＞10%患者9例，占2.3%，血清嗜異凝集反應(yīng)陽性患者7例，占1.8%，兩組患者異型淋巴細(xì)胞＞10%患者及血清嗜異凝集反應(yīng)陽性患者占比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表1。

表1 EBV－DNA陽性患兒與陰性患兒異型淋巴細(xì)胞與血清嗜異凝集反應(yīng)對(duì)比（例，%）

2.2 EBV四種抗體檢測(cè)結(jié)果 對(duì)抗EBV殼抗原抗體（VCA－IgM，VCA－IgG），抗EBV早期抗原抗體（EA－IgG）及抗EBV核抗原抗體（EBNA－I－IgG）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：VCA－IgM陽性率最高，陽性率為87.5%（43／48），明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。表2。

表2 兩組患者EBV四種抗體檢測(cè)結(jié)果對(duì)比（例）

3 討論

嬰幼兒傳染性單核細(xì)胞增多癥最常見的臨床癥狀為發(fā)熱，而引起患兒發(fā)熱的原因很多，最常見的多為病毒、細(xì)菌感染，故對(duì)傳染性單核細(xì)胞增多癥的診斷帶來極大的干擾［4］。除了典型的發(fā)熱、咽峽炎、頸部淋巴結(jié)腫大及肝脾大外，實(shí)驗(yàn)室檢查對(duì)傳染性單核細(xì)胞增多癥的診斷十分重要。通常原發(fā)性EB病毒感染后患者VCA－IgM、VCA－IgG呈陽性，EBVNA－IgG呈陰性。研究顯示［5］，VCA－IgM對(duì)EB病毒感染具有診斷特異性，因此可作為EB病毒感染診斷依據(jù)。但也有研究顯示［6］，由于嬰幼兒體液免疫功能發(fā)育不完善，故上述指標(biāo)體內(nèi)水平較低，不易檢出。而利用EBV與DNA聯(lián)合檢測(cè)則可以避免單一檢測(cè)EBV受體液免疫功能影響的弊端，使檢測(cè)更加精準(zhǔn)［7］。本研究顯示，EBV－DNA陽性的56例患兒中，異型淋巴細(xì)胞＞10%患兒39例，占69.6%，血清嗜異凝集反應(yīng)陽性患兒37例，占66.1%；EBV－DNA陰性患兒386例中，異型淋巴細(xì)胞＞10%患者9例，占2.3%，血清嗜異凝集反應(yīng)陽性患者7例，占1.8%，陽性患者中異常淋巴細(xì)胞及血清嗜異凝集反應(yīng)陽性患兒占比例明顯高于陰性患兒，說明EBV－DNA檢測(cè)準(zhǔn)確性較高，能夠作為臨床EBV診斷依據(jù)。

患兒感染EB病毒后，體內(nèi)首先形成的抗體為抗EBV殼抗原IgM抗體，然后是IgG類抗體。研究發(fā)現(xiàn)［8］，在EB病毒感染的早期，患者體內(nèi)便可出現(xiàn)VCA－IgM，并在體內(nèi)迅速升高，然后逐漸下降；EA－IgG和VCA－IgG通常也在病毒感染時(shí)便出現(xiàn)，但是其在體內(nèi)增長(zhǎng)較VCA－IgM緩慢，通常要在3－5周才會(huì)達(dá)到高峰［9］；EBNA－IgG出現(xiàn)較為緩慢，通常在VCA－IgG和VCA－IgG高峰過后才會(huì)出現(xiàn)，但是其能夠在體內(nèi)保持終身不消失。一般來說對(duì)EBNA－IgG的檢測(cè)最具有代表意義，但是由于其出現(xiàn)緩慢，臨床上往往在感染早期只檢測(cè)VCA－IgM作為診斷依據(jù)［10］。本研究對(duì)四種抗體進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，VCA－IgM陽性率最高，達(dá)到87.5%，且明顯高于正常對(duì)照組，分析原因可能與檢測(cè)時(shí)機(jī)有關(guān)。一般患兒在出現(xiàn)發(fā)熱時(shí)候便立即到醫(yī)院進(jìn)行，此時(shí)正值VCAIgM高峰，故檢測(cè)出VCA－IgM陽性較多。但是僅僅檢測(cè)VCA－IgM不足以做為診斷EB感染的依據(jù)，因?yàn)橛醒芯堪l(fā)現(xiàn)，部分免疫力低下的患兒抗體檢測(cè)可為陰性［11］。另外，一些別的病毒例如巨細(xì)胞病毒、微小病毒以及弓形蟲感染等，同樣會(huì)出現(xiàn)VCA－IgM升高的情況。故應(yīng)當(dāng)對(duì)疑似患兒應(yīng)用VCA－IgM與EBV－DNA聯(lián)合聯(lián)測(cè)，從而提高診斷敏感性，減少不必要的誤診、漏診發(fā)生。

綜上所述，EB病毒血清學(xué)及DNA聯(lián)合檢測(cè)能夠提高嬰幼兒傳染性單核細(xì)胞增多癥診斷準(zhǔn)確性，值得臨床推廣應(yīng)用。

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Clinical application study of EB virus serology and DNA combined detection in infants with infectious mononucleosis

SUN Zhi－h(huán)ui，LIU Peng.
（1 Pediatrics Department；2 Laboratories，the Fifth Center Hospital of Tianjin City，Tianjin300450，China）

ObjectiveTo investigate the value of virus serology and DNA combined detection in infants with infectious mononucleosis.Methods 442cases baby with fever were selected，Among the 48cases of infectious mononucleosis in children as the observation group，Another 50healthy children as control group，Application of real time quantitative PCR（RT－qPCR）EB in peripheral blood virus DNA detection technology of external carrier，The children were given peripheral blood heterotypic lymphocyte and serum heterophile agglutination reaction，And on the single cell EBVDNA load testing，comprehensive comparative analysis of diagnostic effects of EBV－DNA diagnosis.Results The EBVDNA positive patients were atypical lymphocyte in 39＞10%patients，accounted for 69.6%，Serum heterophile agglutination reaction was positive in 37cases，accounted for 66.1%；EBV－DNA negative children with atypical lymphocyte in 9patients with＞10%，accounted for 2.3%，7patients with positive serum eosinophil ISO agglutination reaction，accounted for 1.8%，there were statistical significance between patients with atypical lymphocytes in patients with＞10% and serum eosinophil percentage patients with positive abnormal agglutination reaction in two groups（P＜0.01）；The highest positive rate of VCA－IgM，The positive rate was 87.5%（43／48），Significantly higher than control group（P＜0.01）.Conclusion The combined detection of VCA－IgM and DNA can improve the diagnostic accuracy of infant infectious mononucleosis.

mononucleosis；real－time quantitative PCR；atypical lymphocytes；load

R512.7

A

孫志惠（1975－），女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：兒科感染性疾病。

2014－12－05）

1007－4287（2015）10－1696－03