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甲型H1N1流感住院患者病毒核酸與淋巴細胞百分比的相關(guān)性分析

2015-05-06 08:15劉秀紅趙一鳴孫莉波閆惠平
中國實驗診斷學(xué) 2015年10期
關(guān)鍵詞:流感病毒百分比核酸

劉秀紅,趙一鳴,李 莉,張 欣,孫莉波,閆惠平*,李 寧*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院,北京100069;2.北京市肝病研究所,北京100069;3.北京協(xié)和醫(yī)院基本外科,北京100005)

甲型H1N1流感住院患者病毒核酸與淋巴細胞百分比的相關(guān)性分析

劉秀紅1,2,趙一鳴3,李 莉1,張 欣1,孫莉波1,閆惠平1*,李 寧1,2*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院,北京100069;2.北京市肝病研究所,北京100069;3.北京協(xié)和醫(yī)院基本外科,北京100005)

目的通過對2009年6月1日-2009年12月8日北京佑安醫(yī)院收治的191例(死亡8例)甲型H1N1流感病毒感染確診住院病例的分析,了解發(fā)病期間H1N1病毒感染患者H1N1病毒核酸及淋巴細胞百分比的變化趨勢以及二者之間關(guān)系,以期為臨床提供簡單易掌握的診斷數(shù)據(jù)。方法 用實時RT-PCR檢測H1N1病毒核酸及血常規(guī),并對191例患者的臨床資料進行回顧性分析。結(jié)果 H1N1病毒感染患者的病毒核酸陽性率與淋巴細胞百分比呈強負相關(guān)性(r=-0.950,P<0.001);H1N1病毒感染且并發(fā)肺炎的患者H1N1病毒核酸為陰性時其淋巴細胞百分數(shù)大于病毒核酸陽性時的淋巴細胞百分數(shù)(42.96±2.50>31.63±3.03,P<0.01);在發(fā)病前7天,隨著發(fā)病天數(shù)的增加,肺紋理清晰的患者淋巴細胞百分數(shù)有平滑上升趨勢,而肺紋理增粗和肺炎的患者的淋巴細胞百分數(shù)上升趨勢呈巨齒樣波動;8例死亡病例死亡前的淋巴細胞百分比均低于20%,并在5%-15%范圍內(nèi)無規(guī)律波動。結(jié)論 甲型H1N1病毒能引起淋巴細胞數(shù)量上的降低,患者淋巴細胞百分比的高低變化趨勢在一定程度上預(yù)示病情的輕重,當(dāng)淋巴細胞百分比持續(xù)小于20%,預(yù)示病情危重。

H1N1病毒;核酸;淋巴細胞百分比;住院患者

(Chin J Lab Diagn,2015,19:1717)

世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)在2009年4月,先次報告了在墨西哥檢測出一種人感染的新型豬來源的甲型流感病毒(novel swine-origin influenza A virus,S-OIV)[1]。為避免誤解,WHO宣布將這種新的流感重新命名為“甲型H1N1流感”,其病毒稱為“人A/H1N1病毒”(本文稱H1N1病毒)。此病毒自發(fā)現(xiàn)之日起到2009年7月,幾乎傳播到全世界所有國家,引起800多人死亡,這是自1968年H3N2暴發(fā)以來最大一次人類流感病毒的流行[2]。為了控制此疾病的流行,我國于2009年4月30日宣布將其納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病,并按甲類傳染病的預(yù)防、控制措施及《中華人民共和國國境衛(wèi)生檢疫法》規(guī)定的檢疫傳染病進行管理,建立起有效的每天零報告制度,由定點醫(yī)院對確診病例進行住院隔離觀察治療,并且在監(jiān)測的后期,從確診的H1N1患者中識別出危重患者成為了工作重點。

新甲型H1N1流感病毒為單股負鏈RNA病毒,基因組約為13.6kb,序列分析結(jié)果顯示,該流感病毒為四重配病毒,其基因組8個片段分別來源于近年來流行的4種病毒:NA(神經(jīng)氨酸酶)和M(基質(zhì)蛋白M1、M2)片段來源于1979年以來流行于歐亞大陸的豬流感病毒;HA(血凝素)、NP(核蛋白)和NS(非結(jié)構(gòu)蛋白)片段來源于北美普通豬流感病毒;PB2(RNA聚合酶亞基)和PA(RNA聚合酶亞基)片段來源于禽流感病毒;而PB1(RNA聚合酶亞基)來源于人季節(jié)性H3N2流感病毒[3]。由于人群對新流感病毒缺乏免疫力因而造成每次流感的大流行,而抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換是甲型流感病毒發(fā)生變異的重要原因。所以,WHO認為,人們對于流感還知之甚少,只有從已往流感治療中吸取成功經(jīng)驗。由于北京佑安醫(yī)院是收治新型甲型H1N1流感患者的定點醫(yī)院,我們有住院患者發(fā)病過程中實驗室縱向多時間點的檢測數(shù)據(jù),而這些實驗室數(shù)據(jù)卻很少有人報道,本文回顧性分析了H1N1核酸和血常規(guī)的數(shù)據(jù),希望找到一個簡單易得的判斷預(yù)后指標(biāo),有助于人們更好了解H1N1流感。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧分析2009年6月1日至2009年12月8日由北京佑安醫(yī)院收治的H1N1病毒感染的確診住院病例191例,確診病例診斷標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部《甲型H1N1流感治療方案2009年試行版第一版》[4],實驗室診斷主要是采集鼻咽拭子標(biāo)本進行H1N1病毒的PCR檢測。具體如下:北京佑安醫(yī)院檢測H1N1病毒核酸為陽性的標(biāo)本全部送到北京市疾病控制中心再進行進一步的核實,并由專家小組成員依據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)討論確定。191例患者中有8例為死亡病例,男性5例,女性3例,(男∶女=1.7∶1),平均年齡為48.38歲(22歲-74歲)。另外的183例患者(包括13例隱性感染患者),52.5%為男性(96/183例),47.5%為女性(87/186例),男∶女=1.1∶1,平均年齡為22.27歲(1歲-79歲);其中并發(fā)肺炎18例(9.8%)、支氣管炎3例(1.64%)、哮喘3例、糖尿病、高血壓和急性腸炎各1例。患者的臨床表現(xiàn)多以一種或幾種流感樣癥狀為主,如發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咽痛、流涕、鼻塞、肌肉酸痛、頭痛、乏力、畏寒等,還有腹瀉、嘔吐等腸道感染癥狀。嚴重者可出現(xiàn)肺炎、呼吸衰竭、多器官功能損傷等并發(fā)癥,甚至死亡。

1.2 實驗室檢測方法

1.2.1 H1N1病毒核酸提取 用RNA提取試劑盒(德國Qiagen公司,試劑編號:52904)從取自患者的咽拭子中提取病毒RNA,具體步驟按試劑盒說明操作。

1.2.2 H1N1病毒核酸檢測 (1)方法。應(yīng)用實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法(real time reverse transcription-polymerase chain reaction,real time RTPCR);(2)儀器。PCR儀(ABI7500,美國);(3)試劑。Quanti Tect R Probe RT-PCR試劑盒(德國Qiagen公司,試劑編號:204443)。檢測的擴增引物基因片段包括①甲型流感病毒通用引物M基因(infA-M);②豬甲型流感病毒A型通用引物NP基因(SW infA-NP基因);③豬H1N1流感病毒特異引物HA基因(SW H1-HA基因);④內(nèi)參基因人核糖核酸酶P(RNase P)。具體引物和探針序列請參見WHO所公布的信息[5],具體操作步驟參見試劑盒說明書。

1.2.3 血常規(guī) 取患者2ml抗凝血,用日本sysmex KX-21全自動血液分析儀檢測。血常規(guī)包括血紅蛋白、紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)和白細胞分類,白細胞分類包括淋巴細胞、中性粒細胞和中間細胞(嗜酸細胞、嗜堿細胞和單核細胞)。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,計量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,進行獨立樣本t檢驗、配對t檢驗、方差分析,相關(guān)性分析用直線相關(guān)與回歸分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.01為差異有非常顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H1N1病毒RNA陽性率與淋巴細胞百分數(shù)呈負相關(guān)性

本文的H1N1核酸陽性率計算如下:在發(fā)病的第n天時,共檢測M+N例患者,有N例患者H1N1核酸為陽性,M個患者H1N1核酸為陰性,則H1N1核酸陽性率=N/N+M,陰性率=M/N+M。我們分析了的170例H1N1確診患者(不包括沒有癥狀的隱性感染者13例及死亡病例8例),從圖1A可見,隨著發(fā)病天數(shù)從第1天到11天的延長,H1N1病毒核酸的HA基因、NP基因和M基因的陽性率均呈逐漸下降的趨勢。從發(fā)病第二天到第十天,H1N1核酸陽性率從小到大依次是HA、NP和M基因,也就是說HA基因由陽性轉(zhuǎn)為陰性的速度最快,而M基因陽轉(zhuǎn)陰的速度最慢。在發(fā)病第七天,HA基因、NP基因和M基因的陰性率分別為93.3%(84/90例)、88.4%(76/90例)和65.6%(59/90例)。由于HA、NP和M基因的陽性率的變化趨勢一致,均呈45度角斜線下降趨勢,所以將HA、NP和M基因的陽性率三者取平均值,并與淋巴細胞百分比相比較,從圖1B可見,隨著發(fā)病天數(shù)增加,尤其是第一天到第七天,淋巴細胞百分比呈逐漸上升趨勢,變化范圍從25.5%到41.9%,而H1N1核酸陽性率的變化趨勢與淋巴細胞百分比正好相反呈逐漸下降趨勢,變化范圍從94.8%到0%,二者的相關(guān)系數(shù)r=-0.950,雙側(cè)Pearson檢驗P<0.001,有顯著統(tǒng)計學(xué)意義,說明淋巴細胞百分比與H1N1核酸陽性率呈高度負相關(guān)性,也就是說隨著淋巴細胞數(shù)量逐漸增多,H1N1核酸陽性率逐漸降低,陽轉(zhuǎn)陰率逐漸增多?;貧w方程為:Y(H1N1核酸陽性率)=232.034-5.483X(淋巴細胞百分比),確定系數(shù)R2=0.902,表示H1N1核酸陽性率的降低有90.2%可由淋巴H1N1細胞百分數(shù)的增多來解釋的,一般來說,R2值越大,回歸方程越有價值。

圖1 H1N1核酸陽性率與淋巴細胞百分數(shù)成負相關(guān)性

2.2 不同患者的H1N1 RNA陽性與陰性時的淋巴細胞百分率的變化情況

2.2.1 從圖2A可見,H1N1病毒感染且并發(fā)肺炎的18例患者,當(dāng)H1N1病毒核酸為陰性時,其淋巴細胞百分數(shù)為42.96±2.50,大于病毒核酸陽性時的淋巴細胞百分數(shù)31.63±3.03,差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而H1N1隱性感染13例患者,病毒核酸陽性組的淋巴細胞百分數(shù)為31.86± 3.56,與病毒核酸陰性組的淋巴細胞百分數(shù)30.86 ±2.48相比,差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖2B)。

圖2 不同患者的H1N1 RNA陽性組與陰性組之間的淋巴細胞百分率

2.2.2 在170例H1N1病毒感染住院患者中,肺部胸片示肺紋理清晰40例,肺紋理增強12例,肺炎18例。由于肺紋理增強與肺炎患者的淋巴細胞百分比均在核酸陽性和陰性時差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(數(shù)據(jù)沒表示),為了增大觀察例數(shù)我們將肺紋理增強和肺炎的患者歸為一組共30例,與肺紋理清晰40例患者進行比較。從圖3可見,在發(fā)病第一天和第二天,肺紋理增強和肺炎患者的淋巴百分比(<20%),明顯低于肺紋理清晰者的淋巴百分比(>25%),差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。隨著發(fā)病天數(shù)的增加,尤其是發(fā)病的前7天,40例肺紋理清晰患者的淋巴細胞百分比呈平滑上升趨勢,與不包括隱性感染的170例H1N1病毒感染住院總體患者淋巴細胞百分比的變化趨勢相同,而肺紋理增粗和肺炎的30例患者,其淋巴細胞百分比在發(fā)病早七天呈鋸齒樣波動上升趨勢(見圖3)。

2.3 死亡病例的淋巴細胞改變

8例死亡患者在死亡前的第2-16天,H1N1病毒核酸已由陽性轉(zhuǎn)為了陰性,在血、痰和尿培養(yǎng)標(biāo)本均沒檢測出到H1N1病毒。從圖4可見,只有一位患者在一天(死亡前第9天)的一個檢測時間的淋巴細胞百分比為20.9%,其他患者在1-4次/天的檢測頻率中,淋巴細胞百分比均小于20%,并且在5%到15%范圍內(nèi)無規(guī)則的變化。T細胞亞群檢測結(jié)果見表1,4例死亡患者平均的CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+的絕對數(shù)和CD4+/CD8+平均值分別為396.38個/μl,209個/μl,183.75個/μl和1.14個/μl,除CD4+/CD8+外,前三者數(shù)值遠遠低于正常值(1242±404個/μl,651±209個/μl,524±283個/μl和1.5-2.0),僅為正常值的1/3左右。

3 討論

由于H1N1流感病毒由豬、禽和人三源四基因重配而成[6],用實時RT-PCR檢測呼吸道標(biāo)本(咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或氣管抽取物、痰)中的甲型H1N1流感病毒核酸是當(dāng)時最主要可行的檢測手段。WHO推薦檢測H1N1病毒的擴增引物基因片段包括甲型流感病毒通用引物M基因、豬甲型流感病毒A型通用引物NP基因和豬H1N1流感病毒特異引物HA基因,并且判讀H1N1陽性的標(biāo)準(zhǔn)是M基因陽性,再加上NP或HA有一個陽性。我們觀察到隨著發(fā)病時間的延長,HA、NP和M基因的陽性率均呈逐漸下降趨勢,但是三者由陽性轉(zhuǎn)為陰性的速度是不一樣的,由快到慢依次為HA、NP和M基因,這與流感病毒最易發(fā)生抗原性變異,其中變異率最高的是HA基因[7]是否有關(guān)有待進一步研究。

圖4 8例死亡患者死亡前的淋巴細胞百分比變化趨勢

表1 4位死亡患者T淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)和比值

3.1 淋巴細胞與H1N1病毒核酸陽轉(zhuǎn)陰相關(guān)

當(dāng)病毒感染人體后定會影響到人體免疫系統(tǒng)[8],而淋巴細胞是人體的重要免疫細胞。本文主要分析了血常規(guī)中白細胞計數(shù)及白細胞分類中的數(shù)據(jù),我們觀察到170例H1N1患者的淋巴細胞和中性粒細胞絕對值大小與白細胞計數(shù)多少的變化趨勢相一致,而中間細胞則基本保持在一個水平,不隨白細胞計數(shù)的多少而有所變化(資料沒顯示)。淋巴細胞百分比隨發(fā)病天數(shù)的增加在正常范圍內(nèi)呈上升趨勢,而中性粒細胞百分比則與之相反在正常范圍內(nèi)呈下降趨勢(資料沒顯示)。當(dāng)白細胞計數(shù)變化時,淋巴細胞百分比也隨著變化,淋巴細胞百分比的高低不僅能了解淋巴細胞在白細胞中所占比例的高低,也能了解淋巴細胞絕對值的高低,并且淋巴細胞百分比數(shù)值變化范圍遠小于淋巴細胞絕對值,所以本文主要對變化范圍相對小的淋巴細胞百分比進行了觀察分析。將淋巴細胞百分比高低分為高(>40%)、中(20-40%)、低(<20%)三組,可觀察到在發(fā)病后的前四天內(nèi),高淋巴細胞百分比組的核酸陰性百分比最高,說明淋巴細胞數(shù)量多時(可能免疫細胞沒被破壞或機體免疫力增高)有利于H1N1病毒陽轉(zhuǎn)陰(數(shù)據(jù)沒顯示)。隨著發(fā)病天數(shù)的增加,本文觀察到淋巴細胞百分比是逐漸升高的,與H1N1病毒核酸陽性率下降呈極好的負相關(guān)性,間接說明淋巴細胞百分比與H1N1病毒核酸陽轉(zhuǎn)陰有強的正相關(guān)性。兩者的關(guān)系的解釋可能是病毒進入人體后破壞了人體免疫細胞,使淋巴細胞減少,隨著用藥治療,病毒被控制了,淋巴細胞數(shù)量得已恢復(fù)升高,也可能是人體產(chǎn)生了大量淋巴細胞,有利于病毒的清除。

3.2 淋巴細胞百分比高低與病情嚴重程度相關(guān)

Eun Lee研究[9]表明兒童H1N1感染并發(fā)肺炎時淋巴細胞絕對值及比率與沒有肺炎患者相比更低。我們觀察H1N1感染并發(fā)肺炎的患者(病情重的),當(dāng)其H1N1病毒核酸為陰性時的淋巴細胞百分數(shù)是大于病毒核酸陽性時的淋巴細胞百分數(shù)的,說明淋巴細胞數(shù)量增多有利于病毒的清除;而H1N1隱性感染患者(病情輕的),無論病毒核酸是陽性還是陰性,淋巴細胞百分比組差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義,說明隱性感染者所感染的H1N1病毒毒力相對弱,淋巴細胞在數(shù)量上沒有太大的改變,這從另一側(cè)面似乎又說明病情的嚴重性與核酸是否陰陽無關(guān),而與淋巴細胞的多少有關(guān)。我們觀察到另一個有趣現(xiàn)象,胸片肺紋理增強與肺炎的患者同胸片肺紋理清晰患者一樣,隨發(fā)病天數(shù)的增加,淋巴細胞百分比均呈上升趨勢,只是前者上升的道路是曲折的,而后者上升是平滑的,原因可能是在發(fā)病最初前者的淋巴細胞百分比低于后者,所以淋巴細胞數(shù)量的恢復(fù)比較困難,但還是呈一個上升趨勢。隨后我們分析了8例死亡病例,可以觀察到淋巴細胞百分比在5%到15%范圍內(nèi)無規(guī)則上下波動,沒有上升趨勢,8例死亡病例的淋巴細胞百分比在多時間點的多次檢測中始終小于20%,只有一個患者在一個檢測時間有一次淋巴細胞百分比為20.9%。而這期間的8位患者H1N1病毒核酸已由陽性轉(zhuǎn)為了陰性,充分證明淋巴細胞數(shù)少預(yù)示著病情危重。通常認為人體抵御外來病毒的侵襲主要依賴T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫起作用,當(dāng)流感病毒入侵后,CD8+T細胞與抗原特異性結(jié)合,在共刺激分子和CD4+T細胞的幫助下增殖分化成為特異性的細胞毒T細胞,釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì),清除病毒。EJ等[10]研究表明H1N1流感患者與健康人相比,在發(fā)病的前2天,CD4+T細胞和CD8+T細胞是減少的。Toapanta等[11]實驗證明老年大鼠因?qū)α鞲胁《舅せ畹奶禺怌D8+T細胞百分率減少引起病毒清除和疾病恢復(fù)的延遲。通過對4例死亡患者T細胞亞群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+的絕對數(shù)和CD4+/CD8+的檢測,了解到CD4+T細胞和CD8+T細胞數(shù)量大大減少,有2例患者CD4+T細胞和CD8+T細胞的數(shù)值<200個/μl(此數(shù)值是獲得性免疫缺陷綜合征艾滋病期患者的水平),CD4+/CD8+小于1.5,進一步說明,CD4+T細胞比CD8+T細胞減少的更多,而人體的免疫功能有賴于兩者數(shù)量上的平衡。

總之,本文從縱向多時間點的血常規(guī)檢測數(shù)據(jù)入手,發(fā)現(xiàn)淋巴細胞百分比與H1N1病毒核酸的陽轉(zhuǎn)陰率成正相關(guān)性,并且證明,既使H1N1病毒核酸轉(zhuǎn)陰了,如果隨著發(fā)病天數(shù)的增加,淋巴細胞百分比沒有升高,并且淋巴細胞百分比總是<20%時病情是相當(dāng)危重的。這一研究結(jié)果一方面有助于臨床醫(yī)生通過一個簡單易得的指標(biāo)盡早從甲型H1N1流感患者中識別出危重患者來,另一方面,也有助于人們深入進行T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫清除病毒的機制研究,這樣,更有助于人們控制好H1N1流感的大流行。

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[6]李 剛.甲型H1N1流感病毒的分子特征[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2009,30(3)267.

[7]衛(wèi)生部文件:甲型H1N1流感診療方案(2009試行版第二版).

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Analysis correlativity between viral nucleic acid and lymphocyte percentage on 191 hospitalized patient with pandemic in-fluenza A

LIU Xiu-h(huán)ong,ZHAO Yi-ming,LI Li,et al.
(Beijing YouAn Hospital,Capital Medical University;Beijing Institute of Hepatology,Beijing100069,China)

ObjectiveTo know correlativity between pandemic influenza A(H1N1)viral nucleic acid and lymphocytes percentage(lymph%)of 191patients with H1N1viral infection treatment in YouAn hospital on 1June-8December 2009were useful to provide diagnosis data for doctors.Methods Specimens of H1N1inpatients were tested by haemocyte counts and by real time RT-PCR(polymerase chain reaction).The same time,191case histories were analyzed retrospectively.Results A strong negative correlativity between positive percent of nucleic acid and the lymph%was certified along with onset time extension(r=-0.950,P<0.001).of the H1N1viral infection patients complicated by pneumonia was higher than those with negative percent of viral nucleic acid(42.96±2.50VS 31.63±3.03,P<0.01).Within 7days after onset,the lymph%of patients with clear pulmonary markings was elevation more smoothly than patients with pneumonia and thickness pulmonary markings.The lymph%of 8died patients were persistently less 20% and fluctuation scope was at 50-15%.Conclusion The lymphocyte amount of patients with H1N1influenza virus infection were low resulting from invasion of H1N1influenza virus.The change tendency of lymphocytes percentage indicated the patients’state of the illness.The less 20%persistently and the curve fluctuation of the lymph%imply that the pathogenetic condition was very severe.

H1N1;hospitalized patients;viral nucleic acid;lymphocytes percentage

R511.7

A

劉秀紅(1965-),女,副主任技師,博士,主要從事傳染病檢測早期診斷研究。

2014-11-15)

1007-4287(2015)10-1717-06

佑安肝病艾滋病基金資助科研課題(BJYAH-2011-022,BJYAH-2011-002)

*通訊作者

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