印 璞，李玲霞，高 申＊，宋麗娜，李洪軍，何成彥

（1.吉林省臨床檢驗(yàn)中心，吉林長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130033）

原肌球蛋白3在大腸癌中的表達(dá)和意義

印 璞1，李玲霞2，高 申2＊，宋麗娜2，李洪軍2，何成彥2

（1.吉林省臨床檢驗(yàn)中心，吉林長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130033）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是我國(guó)腫瘤發(fā)病率上升最快的腫瘤之一。全球每年結(jié)直腸癌新發(fā)病病例數(shù)可達(dá)94萬(wàn)，近50萬(wàn)人因結(jié)直腸癌死亡。結(jié)直腸癌患者無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，術(shù)后五年生存率可達(dá)90%［1］，而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，術(shù)后五年生存率僅為65%［2，3］。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在對(duì)實(shí)體腫瘤的分子標(biāo)志物檢測(cè)中顯示出了特有的高靈敏度、特異度［4］。本研究以結(jié)腸腺癌組織、癌旁組織為研究對(duì)象，進(jìn)行雙向電泳和質(zhì)譜分析，篩選結(jié)腸腺癌相關(guān)特異蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 實(shí)驗(yàn)所需大腸癌組織標(biāo)本取自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院就診并手術(shù)治療的大腸癌患者。標(biāo)本離體后立即取材，放入液氮冷凍，－80℃保存。經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)，所取大腸癌組織類型是Dukes C期腺癌。

1.1.2 試劑 固相pH梯度干膠條（pH3－10，17 cm；pH5－8，17cm）、礦物油、碘代乙酰胺（IAM）購(gòu)自Bio－Rad公司（Hercules，CA，USA）、載體兩性電解質(zhì)。尿素、硫脲、精胺、三羥甲基氨基甲烷、CHAPS、丙烯酰胺、TMED、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)G－250、苯甲基磺酰氟（PMSF）購(gòu)于Sigma公司（St1Louis，MO，USA）。瓊脂糖、甲叉雙丙烯酰胺、二硫代蘇糖醇（DTT）、TPCK修飾的測(cè)序級(jí)胰酶購(gòu)自Promeg公司。過(guò)硫酸銨、碳酸氫氨、硝酸銀、甲醛、乙醇、硫代硫酸鈉、冰乙酸為國(guó)產(chǎn)分析純。蛋白質(zhì)定量試劑盒（RCDC Protein Assay Kit）購(gòu)于Bio－Rad公司。液相色譜分析儀購(gòu)自安捷倫公司，LTQXL離子肼質(zhì)譜儀購(gòu)自賽默飛世爾公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品總蛋白提取及蛋白濃度測(cè)定 分別取50mg癌組織及癌旁組織進(jìn)行研磨，加入200μl預(yù)冷的組織蛋白抽提試劑，冰上放置20min。4℃，12 000g離心1小時(shí)，留取上清備用。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，在波長(zhǎng)595nm處比色，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，以A595nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量，分別分裝并保存在－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品蛋白水解多肽混合物的制備 取出凍存總蛋白樣品，平衡至室溫。用3－5倍體積的50 mM NH4HCO3溶解蛋白樣品。加入1M的DTT，調(diào)定終濃度至20mM，56℃室溫、避光放置1h。室溫下加入1M的IAM，調(diào)定終濃度至50mM，室溫、避光反應(yīng)半小時(shí)。反應(yīng)體系中按照蛋白：胰酶以50∶1比例加入，放在37℃水浴箱中過(guò)夜。酶切產(chǎn)物，－80℃凍干保存。

1.2.3 二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分離并鑒定多肽混合物 將樣本用緩沖液溶解，取50μg樣本上樣，經(jīng)反相色譜洗脫的多肽用LTQXL離子肼質(zhì)譜儀檢測(cè)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Thermo Fisher公司的Bioworks 3.3.1SP1軟件，用SEQUEST進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，以鑒定出相關(guān)多肽和蛋白質(zhì)。

1.2.4 免疫印跡試驗(yàn) 采用免疫印跡試驗(yàn)對(duì)選定的目標(biāo)蛋白－TPM3的表達(dá)情況進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。BCA法定量蛋白，使每個(gè)加樣孔中蛋白量相同。TPM3單克隆抗體購(gòu)于Santa Cruz。內(nèi)參照為actin。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用圖譜依據(jù)SEQUEST算法，使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織總蛋白酶解混合物的二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析

腫瘤組織總蛋白經(jīng)酶解后，產(chǎn)物應(yīng)用二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析，對(duì)獲得的多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集、整理，得到614個(gè)蛋白的鑒定資料。

2.2 癌旁組織總蛋白酶解混合物的二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析

癌旁組織總蛋白經(jīng)酶解后，產(chǎn)物應(yīng)用二維液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析，對(duì)獲得的多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集、整理，得到357個(gè)蛋白的鑒定資料。

2.3 腫瘤與癌旁組織差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用譜圖數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)每個(gè)蛋白的豐度。對(duì)于蛋白豐度的變化，我們參照以下標(biāo)準(zhǔn)界定：（1）兩個(gè)樣品中蛋白譜圖數(shù)的差值≥72；（2）兩個(gè)樣品中蛋白譜圖數(shù)的比值≥1。

將腫瘤組織與癌旁組織的蛋白分析數(shù)據(jù)依據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)，得到有顯著差異的蛋白共18個(gè)。TPM3的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 TPM3的質(zhì)譜圖

2.4 TPM3的免疫印跡結(jié)果 見(jiàn)圖2。

圖2 TPM3的免疫印跡圖

3 討論

大腸癌是發(fā)病率和死亡率都較高的腫瘤，結(jié)直腸癌早期的臨床癥狀不明顯，確診時(shí)一般已發(fā)展到中晚期，喪失了治療的最佳時(shí)期，因此對(duì)于腫瘤的早期診斷仍是研究的熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有高度自動(dòng)化、高效率、高通量等優(yōu)勢(shì)，且可以同時(shí)檢測(cè)組織中全部的蛋白質(zhì)，利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，可以發(fā)現(xiàn)發(fā)病早期靈敏度高及特異性強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于腫瘤的早期診斷、早期治療和預(yù)后的預(yù)測(cè)方面都具有非常重要的臨床意義。

本研究對(duì)結(jié)腸腺癌組織、癌旁組織進(jìn)行蛋白組學(xué)技術(shù)研究，選取兩個(gè)樣品中蛋白譜圖數(shù)的差值≥72，并且兩個(gè)樣品中蛋白譜圖數(shù)的比值≥1的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，最終鑒定出18種蛋白。這些表達(dá)有差異的蛋白是從結(jié)腸癌組織、癌旁組織中比較分析而來(lái)，故可認(rèn)為是結(jié)腸癌相關(guān)蛋白。

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）是肌肉收縮過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，廣泛分布于各種真核細(xì)胞中，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)在原核細(xì)胞中存TM。目前，TM中的4個(gè)基因已被確認(rèn)，分別被命名為：TPM1（或α－TM）、TPM2（或β－TM）、TPM3（或γ－TM）、TPM4（或δ－TM）［5］。它們與細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。TM家族表達(dá)下調(diào)可以導(dǎo)致細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，恢復(fù)其表達(dá)水平，可以阻止細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程［6］。TPM3基因，即γ－TM基因，編碼含284個(gè)氨基酸殘基的成纖維細(xì)胞LMWTM30nm即TM5，和含284個(gè)氨基酸殘基的慢收縮骨骼肌HMWA－Tm即TM3，迄今在平滑肌中尚未確認(rèn)有該基因產(chǎn)物。

在試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，TPM3在結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯下降，再運(yùn)用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果與雙向電泳一致。證明了在大腸癌組織中TPM3的含量明顯低于癌旁組織，有研究表明，在肝癌、食管癌、慢粒等腫瘤中TPM3的含量與正常組織都有明顯差異［7，8，9］。這說(shuō)明TPM3在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到了一定的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)TPM3在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下降，提示TPM3可能在結(jié)腸癌中扮演癌癥抑制因子的重要角色，可能成為結(jié)腸癌診斷的分子標(biāo)記物，但要將其應(yīng)用于臨床診斷和治療仍有待進(jìn)一步的研究。

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2014－10－09）

1007－4287（2015）10－1733－03

吉林省科技廳（2011713，20090461，2010739）；吉林省發(fā)改委（2013c026－5）；長(zhǎng)春市科技局（2011125）

＊通訊作者