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表面活性劑法檢測(cè)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的研究

2015-05-06 08:15王賢俊
關(guān)鍵詞:精密度脂蛋白試劑

王賢俊

(溫州市維日康生物技術(shù)研發(fā)中心,浙江溫州325041)

表面活性劑法檢測(cè)高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的研究

王賢俊

(溫州市維日康生物技術(shù)研發(fā)中心,浙江溫州325041)

高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)主要為ApoA1,ApoA1的降低與動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)病率[1]密切相關(guān),目前在臨床工作中應(yīng)用較廣的HDL-C測(cè)定方法有肝素-錳沉淀法、PTA-Mg2+法、PEG修飾酶法(PEGME法)[2,3]、PEG/抗體包裹法(IRC法)[46]、抗體免疫分離法(AB法)[6,7]及勻相法等。本文采用勻相法,選擇兩種不同的表面活性劑及多聚陰離子,根據(jù)脂蛋白的酶反應(yīng)選擇性,直接測(cè)定HDL-C的濃度,并與日本第一化學(xué)藥品株式會(huì)社試劑盒進(jìn)行對(duì)比,對(duì)該參考試劑的所有性能指標(biāo)進(jìn)行全面分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 參考試劑為高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)檢測(cè)試劑盒(溫州市維日康生物科技有限公司);對(duì)比試劑為磷鎢酸鎂法試劑盒(北京中生公司),PEG修飾酶法試劑盒(衛(wèi)生部臨床診斷試劑實(shí)驗(yàn)中心,進(jìn)口分裝),高密度脂蛋白膽固醇勻相法檢測(cè)試劑盒(日本第一化學(xué)藥品株式會(huì)社)。

1.1.2 儀器 奧林帕斯AU2700全自動(dòng)生化分析儀和日立7600全自動(dòng)生化分析儀兩種機(jī)型進(jìn)行實(shí)驗(yàn),具體方法的操作規(guī)程見(jiàn)文獻(xiàn)[8]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 反應(yīng)完成度 由于本次參考試劑采用的計(jì)算方法為終點(diǎn)法,要求反應(yīng)在盡可能短的時(shí)間達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)。所以本次試驗(yàn)觀察反應(yīng)曲線(xiàn)在200秒時(shí)的反應(yīng)完成度。取低、中、高三種濃度的血清分別進(jìn)行測(cè)定并記錄反應(yīng)曲線(xiàn),觀察反應(yīng)完成度。HDL-C血清濃度分別為0.51、1.42、3.24mmol/L。

1.2.2 線(xiàn)性范圍 本參考試劑的線(xiàn)性范圍為0.01-3.57mmol/L。每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次取平均值,對(duì)測(cè)定值與預(yù)期值作回歸分析。

1.2.3 反應(yīng)特異性 為了判斷參考試劑對(duì)HDL-C反應(yīng)的特異性,即只于HDL-C反應(yīng)而不與LDL-C發(fā)生反應(yīng)。取一份血清(LDL-C 2.18mmol/L、HDL-C 1.47mmol/L)分為500μL 10等份,向其中分別加入0.2μmol,0.35μmol,0.5μmol,0.65 μmol,0.8μmol,0.95μmol,1.05μmol,1.2μmol,1.35μmol,1.5μmol的LDL-C純品,混勻后對(duì)10份血清分別進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 回收試驗(yàn) 分別取0.9ml的5份血清樣本中(濃度分別為0.47mmol/L、0.85mmol/L、1.25mmol/L、1.69mmol/L、2.07mmol/L)加入0.1mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為3.28mmol/L),每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次,分別測(cè)定其回收值并計(jì)算回收率。

1.2.5 測(cè)量精密度 取低、中、高三份HDL-C濃度的混合血清在相同條件下,用參考試劑分別對(duì)三份混合血清進(jìn)行日內(nèi)和日間重復(fù)性試驗(yàn),日內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)每份血清重復(fù)檢測(cè)20次,日間重復(fù)性試驗(yàn)每份血清連續(xù)檢測(cè)20天。

1.2.6 干擾試驗(yàn) 分別取6份1ml的相同血清,其中一份做為對(duì)照,其他5份分別加入甘油三酯5.6mg,膽紅素0.2mg,血紅蛋白濃度5.0mg,維生素C 8.0mg,脂肪劑10mg,混勻后用參考試劑進(jìn)行測(cè)定,并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 方法對(duì)比試驗(yàn) 本次試驗(yàn)血清樣本數(shù)量為50份,其濃度分配為低值占30%,正常值占40%,高值占30%,采取雙份測(cè)定樣本,第一次測(cè)定為順序,第二次為反向順序測(cè)定。將參考試劑與PTAMg2+法、PEG修飾酶法及日本一化試劑進(jìn)行比較,測(cè)定結(jié)果進(jìn)行回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)完成度 反應(yīng)曲線(xiàn)圖中300秒處為加入試劑二,加入試劑二后反應(yīng)正式開(kāi)始,觀察三個(gè)濃度水平的反應(yīng)曲線(xiàn)可以發(fā)現(xiàn),從300秒開(kāi)始至400秒反應(yīng)基本達(dá)到終點(diǎn),在500秒時(shí)已經(jīng)達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn),故參考試劑在200秒內(nèi)反應(yīng)完成度良好(見(jiàn)圖1)。

2.2 線(xiàn)性范圍 線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r2為0.998,表明0.01-3.57mmol/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。結(jié)果如圖2所示。

2.3 反應(yīng)特異性 如圖3所示,當(dāng)LDL-C最終濃度達(dá)到5.18mmol/L時(shí),本法測(cè)出的HDL-C值未升高,表明加入LDL-C不會(huì)使HDL-C測(cè)定值升高,該試劑盒特異性良好。

圖1 試劑反應(yīng)曲線(xiàn)

圖2 試劑線(xiàn)性趨勢(shì)圖

圖3 特異性反應(yīng)曲線(xiàn)

2.4 回收試驗(yàn) 參考試劑回收試驗(yàn)結(jié)果良好,見(jiàn)下表1。

2.5 精密度 精密度實(shí)驗(yàn)表明,批內(nèi)精密度和批間精密度分別1.32%-1.89%和1.69%-2.15%,結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 本法對(duì)不同濃度HDL-C標(biāo)本檢測(cè)的回收率

表2 日內(nèi)、日間精密度結(jié)果

2.6 干擾試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果表明甘油三酯≤8.7 mmol/L,膽紅素≤342μmol/L,血紅蛋白≤5g/L,維生素C≤8g/L,脂肪劑≤10mg/mL對(duì)測(cè)定結(jié)果沒(méi)影響。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.7 方法對(duì)比試驗(yàn) 參考試劑方法與PTA-Mg2+法、PEG修飾酶法、日本一化法的結(jié)果相關(guān)性均良好。參考試劑的結(jié)果(Y)與PTA-Mg2+法(X1)、PEG修飾酶法(X2)和日本第一化學(xué)試劑(X3)相關(guān)良好,分別為Y=0.982 X1+0.037(r2=0.9905,n=50),Y=0.991 X2+0.040(r2=0.9915,n=50),Y=0.987 X3+0.043(r2=0.9922,n=50)。對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖4、5、6。

圖4 HDL-C直接法與PTA-Mg2+法的比較

圖5 HDL-C直接法與PEG修飾酶法的比較

圖6 HDL-C直接法與日本一化的比較

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)選用的高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)檢測(cè)試劑盒(溫州市維日康生物科技有限公司)采用表面活性劑消除法,屬于勻相法,試劑為液體雙試劑。試劑一中的表面活性劑a能改變除HDL以外的脂蛋白結(jié)構(gòu)并解離,解離后的微?;懝檀挤肿颖荒懝檀济阜纸獬赡戠尴┩?、脂肪酸和H2O2,其中生成的H2O2因缺乏偶聯(lián)劑時(shí)被消耗而不顯色,此時(shí)HDL顆粒仍完整。當(dāng)加入含有表面活性劑b的試劑二時(shí),能使HDL顆粒解離釋放出膽固醇分子,此時(shí)生成的H2O2由于試劑二中含有偶聯(lián)劑DSBmT,所以參與完整Trinder反應(yīng)而顯色,由于其他脂蛋白解離出的膽固醇分子在前一步反應(yīng)中已被除去,所以此時(shí)顯色產(chǎn)生的吸光度變化多少與樣本中HDL-C含量成比例。

綜上所述,本研究實(shí)驗(yàn)表明了HDL-C表面活性劑直接法檢測(cè)試劑反應(yīng)完成度、線(xiàn)性范圍、特異性、準(zhǔn)確度、精密度、抗干擾等性能指標(biāo)均優(yōu)異。且擁有液體雙試劑穩(wěn)定性好,簡(jiǎn)便快速準(zhǔn)確的特點(diǎn),而與參考方法及其國(guó)外同類(lèi)試劑的方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明了它們具有良好的一致性,符合臨床的檢測(cè)要求。

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2015-03-26)

1007-4287(2015)10-1760-03

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