陳紅惠，劉芳，沈清清

（1.云南文山學(xué)院化工學(xué)院，云南文山663000；2.云南文山學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，云南文山663000）

雪蓮果（Smallanthus sonchifolius，俗名 yacon）又稱雪蓮薯、亞貢，為菊科多年生草本植物[1]。雪蓮果作為含有豐富低聚果糖和酚酸成分的低熱量食品，具有調(diào)節(jié)腸道功能、降血脂、減肥、抗氧化等功效[2-3]，深受消費者青睞，但雪蓮果葉中含有的酚酸、黃酮類、萜類等大量活性成分卻沒有得到重視和開發(fā)。Valentová等的試驗證實雪蓮果葉提取物含有原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、槲皮素等成分[4]，有較強的抗氧化能力，可預(yù)防動脈硬化。研究表明，雪蓮果葉中具有明顯降血糖功效的成分主要與黃酮類化合物有關(guān)[5-8]。

黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂等特殊生理功效，近年來對生物資源中的黃酮利用成為了研究熱點，國內(nèi)外學(xué)者對許多生物資源的黃酮成分的提取及應(yīng)用都進行了大量研究[9-17]，目前對于雪蓮果葉黃酮純化的研究還鮮見報道。在常見的純化方法中，大孔樹脂對于多酚類、黃酮類、生物堿類等活性物質(zhì)具有較強吸附能力，具有分離效果好，吸附速度快，解吸率高，使用方便、成本低廉等優(yōu)點[12，14，18]，成為現(xiàn)今天然產(chǎn)物成分的主要分離方法之一。本試驗通過對9種樹脂進行靜態(tài)吸附和解吸試驗優(yōu)選出適合雪蓮果葉黃酮純化的大孔樹脂，確定了雪蓮果葉黃酮利用大孔樹脂吸附的動態(tài)吸附和解吸工藝條件，旨在為雪蓮果葉黃酮工業(yè)化分離純化及其綜合利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

雪蓮果葉采自云南麗江，置60℃烘箱中干燥，粉碎過65目篩后備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、95%乙醇、甲醇、丙酮均為國產(chǎn)分析純；HPD-100、HPD-450、HPD-722、HPD-300、HPD-5000、HPD-600、AB-8、ADS-17、NKA-9型大孔吸附樹脂均購自滄州寶恩化工有限公司。

722型紫外-可見光分光光度計：上海光學(xué)儀器進出口有限公司；8002型電子恒溫水浴鍋：上海予康科教儀器廠；EYELA N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化；SHB-HIA型循環(huán)水式多用真空泵：河南省太康教材儀器廠；PB-10型pH計：德國Sartorius公司；恒溫水浴振蕩器：上海百興儀器設(shè)備有限公司；玻璃層析柱（Φ2 cm×30 cm）。

1.2 方法

1.2.1 供試液的制備

稱取一定量雪蓮果葉干粉，用40%乙醇溶液，料液比為1∶30（g/mL），70℃下提取2次，每次 1 h，真空濃縮后得到雪蓮果葉粗提液即吸附樣品液。

1.2.2 樣品黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al（NO3）3比色法進行測定。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=1.375 9X-0.005 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。將雪蓮果葉提取液過濾并定容，從中精確吸取1.00 mL，然后進行顯色反應(yīng)，測定其吸光值，由回歸方程可計算出黃酮提取量。

1.2.3 大孔樹脂對雪蓮果葉黃酮的靜態(tài)吸附試驗

1.2.3.1 不同大孔樹脂對雪蓮果葉黃酮的靜態(tài)吸附和解吸試驗

分別稱取已預(yù)處理好的HPD-450、HPD-100、HPD-722、HPD-300、HPD-5000、HPD-600、AB-8、NKA-9、ADS-17型9種大孔吸附樹脂各5 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，各精密加入50 mL雪蓮果葉粗提液，置恒溫水浴振蕩器上在溫度為25℃，振蕩頻率為120 r/min條件下靜態(tài)吸附24 h。收集吸附后樣液，用蒸餾水將樹脂表面黃酮洗凈，抽濾至干然后再將樹脂放入250 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 50%乙醇振蕩解吸24 h，收集解吸液，分別測定以上各溶液中黃酮的含量，計算各樹脂的飽和吸附量、吸附率及解吸率。

式中：C0、C1分別為吸附前后供試液的黃酮濃度，mg/mL；C2為解吸液中黃酮濃度，mg/mL；V為供試液體積，mL；m 為樹脂濕重，g；a為樹脂含水量，%。

1.2.3.2 靜態(tài)動力學(xué)試驗

根據(jù)不同樹脂吸附量和解吸率的結(jié)果比較，選擇HPD-100、HPD-300兩種較理想的樹脂進行吸附考察其吸附速率。稱取該兩種預(yù)處理好的樹脂各5 g裝入具塞錐形瓶中，精密加入一定濃度的雪蓮果葉粗提液50 mL，置恒溫水浴振蕩器上于25℃靜態(tài)吸附，在4h內(nèi)，間隔半小時從中各取1.0 mL吸附液測定其黃酮含量，繪制靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線。

1.2.3.3 靜態(tài)熱力學(xué)試驗

分別稱取5g HPD-100樹脂6份，精密加入不同濃度的雪蓮果葉粗提液50 mL，置恒溫水浴振蕩器上于25℃靜態(tài)吸附24 h，過濾，測定其吸附后樣液的黃酮含量，計算吸附量，繪制吸附等溫線。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂的篩選

要選擇合適的樹脂吸附有效成分，首選要考慮樹脂與有效成分的極性情況、樹脂的比表面積、平均孔徑等性能參數(shù)，最終根據(jù)其對該物質(zhì)的吸附能力和易洗脫能力來評價?？疾?種不同型號的樹脂對雪蓮果葉黃酮的吸附選擇性，經(jīng)靜態(tài)吸附和解吸后，得到不同樹脂的靜態(tài)吸附量、吸附率和解吸率，結(jié)果如表1所示。

表1 9種樹脂靜態(tài)吸附與解吸性能情況Table 1 The performance of static adsorption and desorption with nine macroporous resin

從表1可以看出中極性的樹脂對于雪蓮果葉黃酮的吸附效果均較低，如ADS-17吸附率僅為18.97%，相對來說弱極性和非極性的樹脂對雪蓮果葉黃酮的吸附率和解吸率有很大提高，其中以HPD100和HPD300吸附效果較突出，雖然HPD300的吸附率最高，但是解吸率不如HPD100，綜合考慮有效成分分離效率情況，選擇HPD100用作純化雪蓮果葉黃酮樹脂。

2.2 樹脂靜態(tài)吸附動力學(xué)特性測定

在以上飽和吸附基礎(chǔ)上，考察HPD100和HPD300兩種樹脂的吸附動力學(xué)過程，通過各樹脂飽和吸附量反映樹脂吸附性能差異，動力學(xué)曲線如圖1所示。

從圖1可以看出，這兩種樹脂對雪蓮果葉黃酮的吸附均為快速吸附平衡型，在1 h內(nèi)吸附速率急劇增加，而后趨于穩(wěn)定，在4 h內(nèi)能達到吸附飽和。在動力學(xué)曲線中HPD-300的吸附量略高于HPD-100，但結(jié)合表1中兩種樹脂的靜態(tài)解吸率情況，選擇HPD-100樹脂是較合理的。

圖1 HPD-100、HPD-300樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)曲線Fig.1 Static adsorption kinetic curves of HPD-100 and HPD-300 macroporous resins towards Yacon leaves flavonoids

2.3 樹脂靜態(tài)吸附熱力學(xué)特性測定

研究25℃時HPD-100樹脂在不同雪蓮果葉黃酮提取液濃度下吸附，以濃度為橫坐標(biāo)，吸附量為縱坐標(biāo)，繪制吸附等溫線如圖2所示。

圖2 吸附等溫線Fig.2 Adsorption isotherm curves of HPD-100 resins

由圖2可看出，樹脂吸附量隨著樣液濃度的增加而提高，當(dāng)達到一定濃度時吸附量能達到吸附平衡。

2.4 HPD-100樹脂對黃酮吸附條件的選擇

2.4.1 料液pH對吸附量的影響

由于黃酮類化合物含有酚羥基結(jié)構(gòu)，故調(diào)節(jié)溶液酸堿性可改變黃酮在溶液中存在形式，影響與樹脂的分子間作用力，從而影響其吸附情況。取預(yù)處理好的HPD-100樹脂5.0 g，裝入層析柱中，濕法裝柱。取濃度為0.941 mg/mL的雪蓮果葉黃酮粗提液6份，分別調(diào) pH 為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，以 1.0 mL/min 的速率上樣100 mL，考察上樣液pH樹脂對雪蓮果葉黃酮吸附的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對吸附量的影響Fig.3 Effects of pH on adsorption capacity

由圖3可看出，上樣液pH在2～7范圍內(nèi)吸附量呈現(xiàn)下降趨勢，pH為2時，HPD-100樹脂對雪蓮果葉黃酮的吸附量是最高的，達到51.74 mg/g，當(dāng)pH為6時吸附量為23.59 mg/g，出現(xiàn)大幅下降，可能是由于黃酮結(jié)構(gòu)中含有大量-OH，在溶液中以離子形式存在，當(dāng)溶液在酸性條件下可以使黃酮以分子狀態(tài)存在，可以增加與樹脂間的范德華力作用，有利于被樹脂吸附，從而提高其吸附量。但酸性過強，黃酮類化合物易生成烊鹽，相反使吸附效果變差，而pH增大至堿性，則使-OH解離形成H+，與樹脂的結(jié)合減弱從而吸附量降低。結(jié)合試驗結(jié)果，確定上樣液適宜pH為2。

2.4.2 上樣濃度對吸附量的影響

調(diào)節(jié)雪蓮果葉黃酮粗提液初始濃度分別為0.732、0.939、1.249、1.366、1.796、2.211 mg/mL，調(diào) pH 為 2.0，以1.0 mL/min上樣速率上樣100 mL，考察上樣液濃度對樹脂吸附雪蓮果葉黃酮的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 上樣濃度對樹脂吸附的影響Fig.4 Effects of different concentration on absorption of HPD-100 resins

由圖4可看出，不同質(zhì)量濃度的上樣液對樹脂的吸附量有明顯影響，隨著黃酮濃度的提高吸附量也隨之增加，當(dāng)上樣液濃度增加到1.806 mg/mL時吸附量達到最高，為59.69 mg/g，當(dāng)繼續(xù)增加上樣液質(zhì)量濃度后吸附量出現(xiàn)逐漸降低，這是由于在上樣液質(zhì)量濃度較低時溶液雜質(zhì)較少，樹脂顯示良好吸附性能，吸附量表現(xiàn)出隨上樣質(zhì)量濃度增加而增加的趨勢，但質(zhì)量濃度越高吸附量增加越少，直至吸附飽和，當(dāng)上樣液質(zhì)量濃度過大溶液易渾濁，雜質(zhì)含量也較多，則使樹脂堵塞造成污染，大大降低樹脂的吸附能力，從而出現(xiàn)吸附量下降的情況，綜合考慮雪蓮果葉黃酮吸附液的質(zhì)量濃度為1.806 mg/mL左右為宜。

2.4.3 上柱流速對吸附量的影響

上樣液通過樹脂床的流速快慢對目標(biāo)成分的吸附量及工作效率有較大影響。取預(yù)處理好的HPD-100樹脂5 g上柱，將濃度為0.175 mg/mL的雪蓮果葉黃酮粗提液在pH2.0條件下，分別以0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mL/min的上樣速率進入樹脂柱中進行吸附實驗，當(dāng)流出液吸光值達到上樣液的1/10時，認(rèn)為黃酮已經(jīng)透過，停止上樣，測定流出液黃酮含量，考察不同上樣流速對樹脂吸附量的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 上樣流速對吸附量的影響Fig.5 Effects of moving speed on adsorption capacity

由圖5可看出，流速為0.5 mL/min時吸附量最大，隨著流速增加吸附量逐漸下降。這是由于上樣液流速不同會影響樹脂與目標(biāo)成分的接觸時間，流速過快則黃酮物質(zhì)沒有擴散至樹脂內(nèi)表面就流出，導(dǎo)致泄露點提前，流速減慢能使黃酮物質(zhì)充分接觸，有利于提高吸附效果，但過小的流速會使生產(chǎn)周期延長。綜合以上考慮，上樣液流速以1.0 mL/min較為適宜。

2.5 HPD-100樹脂洗脫條件對洗脫效果的影響

2.5.1 解吸劑種類的選擇

洗脫劑的選擇應(yīng)根據(jù)相似相溶原理，對非極性和弱極性大孔樹脂，洗脫劑極性越小，洗脫能力則越強；對中等極性大孔樹脂和極性較大的化合物，應(yīng)選用極性較大的溶劑較合適。稱取5 g已吸附飽和的HPD-100樹脂4份，分別加入相同濃度（60%）的甲醇、乙醇、丙酮和水溶液作為解吸劑，置恒溫水浴振蕩器上于25℃靜態(tài)解吸4 h，測定解吸液的黃酮含量，考察不同溶劑對雪蓮果葉黃酮的洗脫效果影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同解吸劑對解吸率的影響Fig.6 Effects of different desorption agent on desorption rate

由圖6可看出，有機溶劑的洗脫效果遠好于水溶液，其中丙酮的洗脫效果最好，靜態(tài)解吸率可達93.48%，甲醇和乙醇的洗脫率分別為78.45%和89.25%，而水的洗脫效果最差，洗脫率只有8.09%。由于丙酮的毒性較大，盡管解吸率最高，但考慮到安全性，故應(yīng)選擇成本較低，解吸效果也較好的乙醇作為解吸劑。另外水作為解吸劑來說雖然解吸率很低，但是用水沖洗飽和吸附后樹脂中的雜質(zhì)時也要適量，否則會使已吸附的黃酮物質(zhì)被沖洗下來造成損失。

2.5.2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對洗脫效果的影響

取5 g飽和吸附的HPD-100樹脂上柱，用蒸餾水沖洗干凈雜質(zhì)后，分別用體積濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液洗脫，控制洗脫速率1 mL/min對樹脂進行解吸，測定洗脫液中黃酮的含量，考察不同乙醇濃度對雪蓮果葉黃酮洗脫效果的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對解吸率的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration on adsorption quantity of Yacon leaves flavonoids

由圖7可以看出，以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為洗脫劑得到的解吸效果出現(xiàn)先增加后下降的趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時解吸率最高，達到92.75%，這是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時，黃酮物質(zhì)與樹脂結(jié)合力較強，不能將其洗脫下來，洗脫液中水溶性雜質(zhì)較多，而增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，洗脫液中醇溶性雜質(zhì)增加，洗脫率反而下降，洗脫液中黃酮純度也降低，故選擇體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液作為洗脫劑。

2.5.3 洗脫流速的確定

取5 g飽和吸附的HPD-100樹脂，用蒸餾水沖洗干凈雜質(zhì)后，用60 mL 60%乙醇溶液分別在0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min流速下洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液的黃酮含量，考察洗脫流速對雪蓮果葉黃酮洗脫效果的影響，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可看出，洗脫劑流速對洗脫效果有明顯影響，解吸率隨洗脫劑流速增加呈下降趨勢，當(dāng)流速為0.5 mL/min時解吸率最高，達到96.56%，而流速為2 mL/min時，解吸率只有75.24%。這是由于流速加快致使洗脫劑未能與樹脂充分作用，則洗脫出來的黃酮物質(zhì)較少，而流速減慢能進行充分洗脫，故解吸效率較高，但生產(chǎn)效率低，綜合考慮以上因素，洗脫劑的流速宜控制在1 mL/min為宜。

圖8 洗脫劑流速對洗脫效果的影響Fig.8 Effects of moving speed of desorption agent on desorption rate

2.5.4 洗脫劑最大洗脫體積的確定

稱取5 g HPD-100樹脂，濕法上柱，將已知濃度的雪蓮果葉黃酮提取液以1 mL/min的速度進樣，每隔10 min收集吸附液，直至達到泄露點，吸附飽和后，用少量水洗去樹脂表面的雜質(zhì)，再用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇洗脫，洗脫流速為1 mL/min，分部收集洗脫液，紫外觀察黃酮的洗脫情況，直到無黃酮洗脫出來為至，由此獲得洗脫液的最大洗脫體積，同時繪制黃酮解吸率隨洗脫劑體積變化的動態(tài)洗脫曲線，結(jié)果如圖9所示。

圖9 HPD-100樹脂動態(tài)洗脫曲線Fig.9 Dynamic desorption curve of HPD-100 resins

由圖9可以看出，用70%乙醇對HPD-100樹脂中的黃酮進行洗脫效果好，洗脫峰集中，無拖尾，黃酮物質(zhì)集中在10 mL～35 mL體積范圍內(nèi)被解吸下來，洗脫體積達20 mL時黃酮的濃度達到最大值，之后解吸率開始出現(xiàn)下降，當(dāng)洗脫液最大洗脫體積達114 mL使能將吸附的黃酮基本洗脫完全，解吸率達96.56%，洗脫液用量少，解吸效果好。

3 結(jié)論

本試驗通過靜態(tài)吸附試驗從9種大孔樹脂中篩選出HPD-100型樹脂為雪蓮果葉黃酮純化樹脂，并對影響樹脂動態(tài)吸附和解吸的各因素進行了優(yōu)化，確定了HPD-100型樹脂純化雪蓮果葉黃酮的工藝條件為：將上樣液黃酮在質(zhì)量濃度為1.806 mg/mL，pH為2.0，上柱流速1 mL/min條件下進行吸附，用60%乙醇溶液以1 mL/min流速洗脫，洗脫體積為114 mL，解吸率為96.56%，雪蓮果葉中黃酮純度可由18.50%提高到56.24%。該工藝操作簡便，純化效果明顯，得率高，可為雪蓮果葉黃酮的后續(xù)研究及應(yīng)用提供一定技術(shù)參考。

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