王曉峰，孔晨飛，王 偉，張?zhí)旆颍?/p>

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院1.口腔科；2.科學(xué)研究中心，吉林長(zhǎng)春130033）

Syndecan1慢病毒干涉質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)舌鱗癌CAL27細(xì)胞增殖的影響

王曉峰1，孔晨飛2，王 偉1，張?zhí)旆?＊

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院1.口腔科；2.科學(xué)研究中心，吉林長(zhǎng)春130033）

目的 探討RNA干擾Syndecan1基因?qū)ι圜[癌CAL27細(xì)胞增殖的影響，闡明其作用機(jī)制。方法 構(gòu)建靶向基因Syndecan1的siRNA載體重組質(zhì)粒pDSL－h(huán)pUGIP－Syndecan1－1834、pDSL－h(huán)pUGIP－Syndecan1－1588、pDSL－h(huán)pUGIP－Syndecan1－544作為RNA干擾質(zhì)粒組，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照質(zhì)粒組（pDSL－h(huán)pUGIP－control siRNA質(zhì)粒）；采用熒光定量PCR檢測(cè)Syndecan1mRNA的表達(dá)水平和表達(dá)抑制率；采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)CAL27細(xì)胞的增殖率。結(jié)果 倒置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞感染率為90%。熒光定量PCR檢測(cè)，RNA干擾組Syndecan1mRNA表達(dá)水平低于陰性對(duì)照組（P＜0.01），平均抑制率為68.6%。細(xì)胞增殖率檢測(cè)，與陰性對(duì)照組比較，RNA干擾質(zhì)粒組細(xì)胞增殖率明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論 干擾Syndecan1可抑制該基因的轉(zhuǎn)錄，并促進(jìn)CAL27細(xì)胞的增殖。

Syndecan1基因；舌鱗癌；CAL27細(xì)胞；RNA干擾

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1447）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤。舌鱗狀細(xì)胞癌是最常見(jiàn)的口腔鱗癌類型，由于其手術(shù)范圍相對(duì)局限，腫瘤易發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致舌鱗癌易復(fù)發(fā)，預(yù)后不良［1］。Syndecan1是硫酸類肝素蛋白聚糖家族（Heparin－sulphateproteoglyeans，HsPGs）的syndecans亞家族成員之一。Syndecan 1在多種上皮性腫瘤細(xì)胞表面均有表達(dá)，是腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境成分之間交流中的橋梁，在腫瘤細(xì)胞分化、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用［2］。

我們構(gòu)建了Syndecan1干涉慢病毒載體，轉(zhuǎn)染舌鱗癌CAL27細(xì)胞，觀察了Syndecan1siRNA質(zhì)粒在CAL27細(xì)胞中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討Syndecan1基因在舌鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 RNAiso Plus提取試劑盒、PCR試劑盒、PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒購(gòu)買于TaKaRa公司；感受態(tài)細(xì)菌購(gòu)自天根公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)買于Axygen公司；BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自NEB公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Promega公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量染料購(gòu)自大連TaKaRa寶生物工程有限公司；CAL27細(xì)胞、慢病毒表達(dá)載體四質(zhì)粒系統(tǒng)包括載體質(zhì)粒Entry載體pEN＿h(yuǎn)H1c、包裝質(zhì)粒pMD，pAX及Destination載體pDSL＿h(yuǎn)pUGIP為本實(shí)驗(yàn)室留存。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒干涉質(zhì)粒的構(gòu)建 用TE buffer稀釋互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，使其終濃度為50μmol／L；將干涉片段進(jìn)行退火：分別吸取25μl（50μl體系）溶解好的成對(duì)干涉片段于PCR管中，混勻，95℃水浴5分鐘，關(guān)閉水浴自然降溫至室溫，使互補(bǔ)的寡核苷酸鏈退火；將退火后的寡核苷酸鏈插入Entry載體，轉(zhuǎn)化連接子，測(cè)序；將測(cè)序正確的Entry clone與Destination載體進(jìn)行同源重組（重組體系：Entry clone：50－150ng；Destination vector（150ng／μl）：1 μl；LR ClonaseTMII enzyme mix：2μl；TE buffer，pH8.0：補(bǔ)足至10μl）。

將重組體系置于25℃水浴中1h；加入1μl Proteinase K，于37℃10min終止反應(yīng)；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)Stb13，挑取單克隆，進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 慢病毒包裝和感染 將人胚腎細(xì)胞293T接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)板中，溫箱培養(yǎng)20h細(xì)胞貼壁后匯合度達(dá)到80%－90%可進(jìn)行轉(zhuǎn)染；用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將含有目的基因的慢病毒質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G按照4∶3∶1比例，8μg體系DNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；8h后更換新鮮培養(yǎng)基；分別于48h、72h和96h收集病毒上清液并用0.45μm濾膜過(guò)濾；將過(guò)濾后病毒上清約15ml放入50ml超濾管，4℃，4 500rpm離心0.5－1h濃縮病毒，可收集病毒濃縮液約200μl；將50μl病毒濃縮液、8μg／ml聚凝胺與相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基混合，侵染目的細(xì)胞；6－8h后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，基因干涉情況可在病毒侵染后48h后對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 使用TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑盒提取哺乳動(dòng)物細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄使用Promega公司的ImProm－IITMReverse Transcription System試劑盒（A3800）進(jìn)行。

1.2.4 Real－time PCR實(shí)驗(yàn) PCR實(shí)驗(yàn)采用兩步法進(jìn)行，反應(yīng)條件為95℃60s，95℃15s和60℃60s，反應(yīng)45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)中使用的DNA染料為帶有熒光染料的PCR反應(yīng)預(yù)混合物SYBR Green Realtime PCR Master Mix。所得結(jié)果的Cp值（threshold cycle）為達(dá)到超出熒光信號(hào)的檢測(cè)閾值時(shí)所需的循環(huán)數(shù)。所得數(shù)據(jù)用2－ΔΔCp方法來(lái)計(jì)。Syndecan1上游引物序列：5’－AGGACGAAGGCAGCTACTCCT－3’，下游引物序列：5’－TTTGGTGGGCTTCTGGTAGG－3’，β－actin，上游引物：5’－TGACGTGGACATCCGCAAAG－3’，下游引物序列：5’－CTGGAAGGTGGACAGCGAGG－3’。

1.2.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 1.0×105細(xì)胞接種于35mm皿中。每24h胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Syndecan1基因mRNA表達(dá)水平、細(xì)胞增殖數(shù)以±s表示，組間比較采取單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率 倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，可觀察到細(xì)胞帶有綠色熒光（圖1），表明重組的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入了293FT包裝細(xì)胞中。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，感染CAL27細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察并細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算感染效率為90%，表明重組的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入CAL27細(xì)胞中（圖2）。

2.2 Syndecan1慢病毒干涉質(zhì)粒的驗(yàn)證 如圖3所示，RNA干擾質(zhì)粒組Syndecan1mRNA表達(dá)抑制率分別為67.6%、58.4%和79.9%，平均抑制率為68.6%。

圖1 轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒的293FT細(xì)胞

圖2 感染慢病毒的CAL27細(xì)胞

2.3 干涉Syndecan1促進(jìn)CAL27細(xì)胞增殖 以各組CAL27細(xì)胞增殖數(shù)作為縱坐標(biāo)，以時(shí)間作為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線（圖4）。培養(yǎng)72h后，Syndecan1RNA干擾質(zhì)粒組CAL27細(xì)胞生長(zhǎng)速度均明顯高于對(duì)照組。

圖4 細(xì)胞增殖率數(shù)

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道，Syndecan 1表達(dá)下降或缺失與結(jié)直腸癌的組織低分化和臨床分期高［3］、皮膚基底細(xì)胞癌強(qiáng)侵襲性［4］、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的不良預(yù)后［5］等多項(xiàng)因素有關(guān)。上述研究表明，Syndecan1在多種惡性腫瘤中均有異常表達(dá)，能夠調(diào)節(jié)正常細(xì)胞及多種腫瘤細(xì)胞凋亡、增殖或細(xì)胞周期功能。但在舌鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及具體分子機(jī)制的研究尚處于空白階段。

本實(shí)驗(yàn)利用siRNA技術(shù)構(gòu)建了Syndecan1siRNA慢病毒質(zhì)粒，成功干擾CAL27細(xì)胞中Syndecan1mRNA的表達(dá)水平，使得細(xì)胞增殖率明顯增加，初步發(fā)現(xiàn)了Syndecan1基因?qū)ι圜[癌細(xì)胞的影響。

本項(xiàng)研究中構(gòu)建了pDSL－h(huán)pUGIP－Syndecan1重組慢病毒表達(dá)載體，用慢病毒重組質(zhì)粒及空載體陰性對(duì)照分別感染舌鱗癌CAL27細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察，感染細(xì)胞均呈明顯綠色熒光。運(yùn)用RT－PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)干涉質(zhì)粒的干涉效果進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了干擾Syndecan1后細(xì)胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)敲除內(nèi)源Syndecan1后，舌鱗癌細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)。這一結(jié)果提示我們Syndecan1可能在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著抑癌作用。

［1］Greenlee RT.Cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2001，51（1）：15.

［2］BartlettAH，HayashidaK，ParkPW.Molecular and cellular mechanisms of syndecans in tissue injury and inflammation［J］.Mol Cells，2007，24（2）：153.

［3］Lundin M，Nordling S，Lundin J，et al.Epithelial syndecan 1expression is associated with stage and grade in colorectal cancer［J］.Oncology，2005，68（4－6）：306.

［4］Bayer－Gamer IB，Dilday B，Sanderson RD，et al.Syndcean 1expression is decreased with increasing aggressiveness of basal cell careinoma［J］.Am J Dermato Pathol，2000，22：119.

［5］Harada K，Masuda S，Hirano M，et al.Reduced expression of syndcean－1correlates with histologic dedifferentiation，lymph node metastasis，and poor prognosis in inirahepatic cholangioeareinoma［J］.Hum Pathol，2003，34（9）：857.

Effect of RNA interference of Syndecan1 gene on proliferation of tongue squamous carcinoma CAL27 cells

WANG Xiaofeng，KONG Chen－fei，WANG Wei，et al.（Department of Stomatology，China－Janpan Union Hospital，Jilin University，Chanchun130033，China）

Objective To investigate the effect of RNA interference of Syndecan1gene on the cell proliferation of tongue squamous carcinoma CAL27cells，and to elucidate the mechanism.Methods Three siRNA plasmids targeting human Syndecan1gene，including pDSL－h(huán)pUGIP－Syndecan1－1834、pDSL－h(huán)pUGIP－Syndecan1－1588and pDSL－h(huán)pUGIP－Syndecan1－544，were constructed and regarded as RNA interference plasmid grous.pDSL－h(huán)pUGIP－control siRNA plasmid was regarded as negative control.RT－PCR was used to detect the expression of Syndecan1mRNA and the inhibitory rates of CAL27cells was evaluated.Results The infection rate of cells was 90%under inverted fluorescence microscope；the RT－PCR results showed that the levels of Syndecan1mRNA in RNA interference plasmid grous were lower than those in negative control group（P＜0.01），and the average inhibitory rate was 68.6%.Compared with negative control，the proliferation rates of CAL27cells in RNA interference plasmid grous were increased（P＜0.01）.Conclusion Interference of Syndecan1gene might inhibit the transcription of the gene and further increase the proloferation of CAL27cells.

Syndecan1gene；tongue squamous carcinoma；CAL27cells；RNA interference

R739.86

A

2014－11－26）

1007－4287（2015）09－1447－03

吉林省科技廳自然科學(xué)基金課題（2012150780）

＊通訊作者