馮達(dá)紅，王 敏

（1.商洛市商州區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西商洛726000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110004）

血清cf－DNA水平對(duì)子宮頸癌患者診斷和生存狀況的判斷價(jià)值

馮達(dá)紅1，王 敏2

（1.商洛市商州區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西商洛726000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng)110004）

目的 探討血清cf－DNA定量檢測(cè)在宮頸癌輔助診斷及生存狀況判斷中的價(jià)值。方法 分別采集2008年3月至2009年3月我院收治的宮頸癌患者及門(mén)診體檢健康婦女各100例的血清。運(yùn)用熒光定量RT－PCR方法檢測(cè)血清cf－DNA含量，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清中鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCC）、細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA21－1）、糖類(lèi)抗原125（CA125）、糖類(lèi)抗原19－9（CA19－9）的含量。結(jié)果 宮頸癌患者和健康對(duì)照者血清cf－DNA濃度檢測(cè)結(jié)果分別為134.5（7.9－1721.3ng／ml），18.3（0.32－47.5）ng／ml，宮頸癌患者的cf－DNA明顯高于健康對(duì)照組（Z＝－7.324，P＜0.001）。用ROC曲線(xiàn)分析血清cf－DNA濃度對(duì)宮頸癌患者的診斷效能，其曲線(xiàn)下面積（0.923），高于傳統(tǒng)指標(biāo)血清SCC（0.721）、CYFRA21－1（0.734）、CA125（0.652）、CA19－9（0.617）。生存時(shí)間＞5年患者的血清cf－DNA濃度明顯低于生存時(shí)間＜5年的患者（Z＝6.438，P＜0.001）。結(jié)論 血清cf－DNA水平有助于宮頸癌的輔助診斷及預(yù)后判斷。血清cf－DNA對(duì)宮頸癌的輔助診斷價(jià)值要優(yōu)于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物。

宮頸癌；cf－DNA；腫瘤標(biāo)記物，生存時(shí)間

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1475）

宮頸癌是女性常見(jiàn)的生殖道腫瘤，是女性第二大高發(fā)癌癥［1］。早期診斷和及時(shí)治療宮頸癌對(duì)降低宮頸癌發(fā)生率和病死率具有重要的意義。常見(jiàn)的宮頸癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物有鱗狀細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC）、細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRA21－1）、糖類(lèi)抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、糖類(lèi)抗原19－9（carbohydrate antigen 19－9，CA19－9）［2，3］。近年來(lái)外周血游離DNA（cell－free DNA，cf－DNA）已成為檢測(cè)多種腫瘤的標(biāo)志物之一［4－6］。因此我們對(duì)2008年3月至2009年3月確診的100例宮頸癌患者的外周血cf－DNA、SCC、CYFRA21－1、CA125和CA19－9水平進(jìn)行了檢測(cè)，分析其與宮頸癌患者的診斷與生存狀況的關(guān)系。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)探討血清cf－DNA對(duì)宮頸癌診斷和生存狀況的判斷價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2008年3月至2009年3月于我院婦科住院宮頸癌患者100例，其中鱗癌患者74例，腺癌患者26例。按國(guó)際婦產(chǎn)科協(xié)會(huì)宮頸癌分期標(biāo)準(zhǔn)分期，Ⅰ期62例，年齡32－65歲，平均48.31±8.92歲；Ⅱ－Ⅲ期38例，年齡35－73歲，平均52.95±7.81歲。細(xì)胞分級(jí)：高分化23例，中分化者47例，低分化者25例，無(wú)法分級(jí)者5例。診斷均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)，均無(wú)其他合并癥。同期門(mén)診體檢健康婦女100名，年齡28－62歲，平均43.31±9.24歲。記錄宮頸癌患者的死亡情況，時(shí)間截止至2014年3月。

1.2 標(biāo)本采集 采集研究對(duì)象外周靜脈血5ml置于含有分離膠的生化管中，輕輕顛倒混勻4－5次，放置30min，待血液充分凝固后以離心半徑8cm 3 000r／min離心10min，分離血清，置于－20℃冰箱中保存待測(cè)。

1.3 血清cf－DNA的測(cè)量 （1）血清cf－DNA的抽提：采用上海奇諾腫瘤生物技術(shù)公司研制的PAS血清游離DNA抽提試劑，其操作步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。（2）EGFR引物［7］：上游引物：5’－CCTGTCATAAGTCTCCTTGTTGAG－3’；下游引物：5’－CAGTCTGTGGGTCTAAGAGCTAATG－3’；（3）熒光定量PCR檢測(cè)EGFR胞漿區(qū)外顯子28編碼引物序列，取2μL的DNA進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，據(jù)公式計(jì)算出血清游離DNA含量（單位：拷貝數(shù)／ml血清）。C＝10×Q／Vext［（公式中C：EGFR拷貝數(shù)、Q：CPD（Cytoplasmic Domain）拷貝數(shù)、Vext：用于抽提DNA的血清體積（mL）］，再將C按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)轉(zhuǎn)換得到游離DNA含量（ng／mI）。

1.4 血清SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的檢測(cè) 在化學(xué)發(fā)光儀ARCHITECT i2000（美國(guó)雅培公司）上進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照儀器和試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，SCC以1.5μg／L為陽(yáng)性界值，CYFRA21－1以3.3ng／ml為陽(yáng)性界值，CA125以35U／ml為陽(yáng)性界值，CA19－9以40U／ml為陽(yáng)性界值。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，cf－DNA及SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的濃度以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌患者與健康對(duì)照血清cf－DNA濃度

宮頸癌患者和健康對(duì)照者血清cf－DNA濃度檢測(cè)結(jié)果（以19ng／ml作為陽(yáng)性臨界值）分別為134.5（7.9－1721.3ng／ml），18.3（0.32－47.5）ng／ml，宮頸癌患者的cf－DNA明顯高于健康對(duì)照組（Z＝－7.324，P＜0.001）。

2.2 SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的濃度

采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)100例宮頸癌患者和100名健康對(duì)照者血清SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的含量，見(jiàn)表1。

表1 宮頸癌患者和健康對(duì)照者SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的濃度

2.3 各檢測(cè)項(xiàng)目對(duì)宮頸癌癌診斷價(jià)值的比較

血清游離DNA含量和腫瘤標(biāo)志物SCC、CYFRA21－1、CA125對(duì)宮頸癌診斷價(jià)值比較，見(jiàn)表2。對(duì)宮頸癌患者血清cf－DNA濃度及SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9分別結(jié)合健康對(duì)照組做ROC曲線(xiàn)，其曲線(xiàn)下的面積（AUC）分別為0.923、0.721、0.734、0.652、0.617。

2.4 宮頸癌患者血清cf－DNA及腫瘤標(biāo)志物與生存狀況的關(guān)系

根據(jù)患者治療后生存時(shí)間是否＞5年，將100例宮頸癌患者分為兩組，回顧性分析這兩組患者血清cf－DNA及腫瘤標(biāo)志物，見(jiàn)表3。

表2 各種腫瘤標(biāo)志物的宮頸癌診斷價(jià)值

3 討論

目前中國(guó)宮頸癌發(fā)病率和病死率處于相當(dāng)高的水平，2003－2007年宮頸癌發(fā)病率為9.62／10萬(wàn)，同期宮頸癌死亡率為2.54／10萬(wàn)，在癌癥死亡原因中排列第14位［8］。宮頸癌的早期篩查及診治成為保障女性健康的重要措施之一。積極尋找一種測(cè)量方法簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小、靈敏度高、特異性好的新型腫瘤標(biāo)志物對(duì)于宮頸癌的早期輔助診斷和治療具有非常重要的意義。宮頸癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物是宮頸癌組織和細(xì)胞由于癌基因及其產(chǎn)物的異常表達(dá)所產(chǎn)生的抗原和生物活性物質(zhì)，其對(duì)宮頸癌的輔助診斷、估計(jì)預(yù)后及靶向治療等均具有重要指導(dǎo)意義［9］。但是單項(xiàng)使用腫瘤標(biāo)志物對(duì)早期宮頸癌檢測(cè)的靈敏度和特異度均不能滿(mǎn)足臨床需要，常常需要聯(lián)合檢測(cè)來(lái)提高宮頸癌檢測(cè)的靈敏度［3，10］。自從1977年Leon等［11］發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者體內(nèi)存在cf－DNA之后，血cf－DNA逐漸成為腫瘤標(biāo)相關(guān)志物之一，引起廣泛的關(guān)注。本研究通過(guò)檢測(cè)宮頸癌患者和健康對(duì)照者血清cf－DNA含量，我們發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者的血清cf－DNA水平明顯高于健康對(duì)照者（P＜0.001），這一結(jié)果說(shuō)明了血清cf－DNA濃度的升高與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。

臨床上常用來(lái)檢測(cè)宮頸癌的腫瘤標(biāo)志物有SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9等［2，9］。SCC是一種特異性高的鱗癌腫瘤標(biāo)志物，對(duì)所有鱗狀上皮細(xì)胞起源的癌癥如宮頸癌、食管癌等的診斷及預(yù)后判斷有輔助作用［12］。目前研究發(fā)現(xiàn)CYFRA21－1在某些惡性腫瘤患者升高，如肺癌、宮頸癌及消化道腫瘤等［13，14］。血清CA125是宮頸癌腺癌常用的篩查指標(biāo)。CA19－9是大分子量的糖蛋白抗原在各種腺癌中都可升高，特異性較差。本次實(shí)驗(yàn)中宮頸癌患者SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9含量均高于健康對(duì)照者，其中，SCC、CYFRA21－1和CA125具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.05），CA19－9未見(jiàn)顯著差異。在cf－DNA與SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9的ROC曲線(xiàn)下面積及靈敏度、特異度相比較后發(fā)現(xiàn)，cf－DNA的ROC曲線(xiàn)下面積（0.923）、靈敏度（81.0%）、特異度（93.0%）及準(zhǔn)確性（87.0%）均要高于SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9。

一些研究發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)高低與癌癥生存時(shí)間的關(guān)系密切相關(guān)［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生存時(shí)間大于5年的宮頸癌患者cf－DNA、SCC與CYFRA21－1的表達(dá)均低于生存時(shí)間小于5年的患者。因此，這三種腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平可以初步反映宮頸癌癌患者生存期長(zhǎng)短的重要指標(biāo)，可用作評(píng)估患者的生存時(shí)間。因此，本研究認(rèn)為，cf－DNA對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值要優(yōu)于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物SCC、CYFRA21－1、CA125、CA19－9。另外cf－DNA與SCC、CYFRA21－1對(duì)判斷宮頸癌患者的生存狀況有一定的指導(dǎo)意義。

表3 宮頸癌患者血清cf－DNA及腫瘤標(biāo)志物與生存狀況的關(guān)系

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Judgment Value of diagnosis and survival condition of cf－DNA serum level in patients with cervical cancer

FENG Dahong，WANG Min.（Shangluo District People＇s Hospital of Shangluo City，Shangluo 726000，China）

Objective To investigate the quantitative detection of serum cf－DNA in the diagnosis and survival time of cervical cancer.Methods To take serum samples from 100patients diagnosed with cervical cancer and 100healthy controls from March 2008to March 2009in our hospital.Fluorescence quantitative RT－PCR method was used to detect serum cf－DNA content，chemiluminescence was taken to detect the level of serum squamous cell carcinoma antigen（SCC），cytokeratin 19fragment（CYFRA21－1），carbohydrate antigen 125（CA125），sugar antigen 19－9（CA19－9）.Results The concentration of serum cf－DNA in cervical cancer patients and healthy controls were 18.3（0.32－47.5）ng／ml，134.5（7.9－1721.3ng／ml），repectively.The concentration of serum cf－DNA in cervical cancer patients was significantly higher than the control group（Z＝－7.324，P＜0.001）.ROC curves was used to analysis the diagnostic performance of serum cf－DNA in cervical cancer patients with，the area under the curve（0.923）was higher than the traditional serum indicators such as SCC（0.721），CYFRA 21－1（0.734），CA125（0.652），CA19－9（0.617）.Concentration of serum cf－DNA in patients whose survival time was less than 5－year was significantly lower than it in the the patients whose survival time more than 5years（Z＝6.438，P＜0.001）.Conclusion The level of serum cf－DNA may benefit the diagnosis and prognosis of cervical cancer.The aided diagnostic value of serum cf－DNA in cervical cancer was better than conventional tumor markers.

cervical cancer；cf－DNA；tumor markers，survival time

R737.33

A

2014－07－22）

1007－4287（2015）09－1475－03