黃 璐,王洪旭,殷 廷,曹九零,溫成榮,宋 爽

(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116034)

PMP-HPLC-MS分析扇貝內(nèi)臟多糖的組成

黃 璐,王洪旭,殷 廷,曹九零,溫成榮,宋 爽*

(大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心,遼寧大連 116034)

本研究以蝦夷扇貝加工副產(chǎn)物內(nèi)臟為原料制備多糖,采用化學(xué)方法測(cè)定蝦夷扇貝內(nèi)臟多糖(SVP)中蛋白質(zhì)含量為4.09%,中性糖含量為75.37%,硫酸根含量為0.63%,硫酸多糖含量為8.77%,紅外光譜顯示了多糖特征吸收峰。采用PMP-HPLC-PDA-MS分析扇貝內(nèi)臟多糖酸降解產(chǎn)物,確定主要組成單糖是Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc,Ara,另外還含有少量的GlcN,GalN,GalA和Glc;并由二糖片段推測(cè)扇貝內(nèi)臟中存在硫酸軟骨素或其類似物,以及三種結(jié)構(gòu)中存在糖醛酸與己糖重復(fù)二糖片段的多糖。本研究提供了扇貝內(nèi)臟多糖的信息,有助于這一加工副產(chǎn)物的開發(fā)利用。

扇貝,內(nèi)臟,多糖,PMP-HPLC-MS

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)是貝類水產(chǎn)品的重要品種,可加工貝柱和柱連籽產(chǎn)品,而內(nèi)臟是加工的副產(chǎn)物,作為低值飼料使用甚至被丟棄。殷紅玲等[1]對(duì)蝦夷扇貝內(nèi)臟多糖的酶解提取方法進(jìn)行了優(yōu)化,并證實(shí)提取出的蝦夷扇貝內(nèi)臟多糖具有羥基自由基清除活性。閆雪等[2]從蝦夷扇貝內(nèi)臟中提取純化得到的多糖組分SVP-12,并測(cè)定了它的硫酸根含量,氨基己糖含量,分子質(zhì)量,氣相色譜法分析了單糖組成。李廣靖等[3]從蝦夷扇貝軟體部下腳料中提取出糖胺聚糖,并證實(shí)它具有一定的抗氧化活性和低弱的抗凝血活性。本研究將借助化學(xué)和儀器方法,分析蝦夷扇貝內(nèi)臟中多糖的種類和結(jié)構(gòu)特征,為開發(fā)利用這一生物資源提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis) 由大連獐子島漁業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。將新鮮蝦夷扇貝內(nèi)臟取出,冷凍干燥,粉碎,過20目篩,得扇貝內(nèi)臟粉,儲(chǔ)藏于-20℃冰箱中備用。胰蛋白酶(250N.F. U/mg)、木瓜蛋白酶(3500U/mg)、肝素、透明質(zhì)酸 購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;木糖、D-葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、硫酸軟骨素、D(+)-氨基半乳糖鹽酸鹽、D-核糖 購(gòu)自Sigma;巖藻糖、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽、鼠李糖 購(gòu)自Fluka;D-半乳糖 購(gòu)自BIO BASIC INC;PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮) 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-2100型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯上海儀器有限公司;液相色譜線性離子阱質(zhì)譜儀 德國(guó)賽默飛世爾科技公司;傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)鉑金埃爾默儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SVP的制備 蝦夷扇貝內(nèi)臟粉加入25倍水,用6mol/L的NaOH調(diào)pH至8.0,溫度37℃,加入2.0%的胰蛋白酶,水解4h后,升溫至50℃,再加入2.0%木瓜蛋白酶,水解4h后,升溫至100℃滅酶10min,冷卻至室溫后,調(diào)至中性,離心10min(4000r/min),取上清液加3倍體積95%乙醇,醇沉12h,離心10min(4000r/min),取沉淀,冷凍干燥得扇貝內(nèi)臟粗多糖。將扇貝內(nèi)臟粗多糖配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的水溶液,用NaOH調(diào)節(jié)至pH為9,然后加七分之一體積的30%H2O2,在60℃水浴條件下加熱2h,取出冷卻至室溫,加3倍體積無水乙醇,醇沉12h,離心,取沉淀,冷凍干燥后得到SVP,得率1.11%。

1.2.2 SVP的組成分析 蛋白質(zhì)含量采用福林酚法測(cè)定[4],中性糖含量采用苯酚硫酸法測(cè)定[5],硫酸根含量采用明膠-比濁法測(cè)定[6],硫酸多糖含量以硫酸軟骨素為對(duì)照品采用1,9二甲基亞甲藍(lán)光度法測(cè)定[7]。

1.2.3 紅外光譜分析 將樣品分別與KBr以1∶100(W/W)比例混合研細(xì)后,以KBr為本底,在4000～400cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描紅外吸收。

1.2.4 PMP柱前衍生化法分析SVP的組成

1.2.4.1 糖樣的制備 稱取SVP 4mg,分別溶于1mL 2mol/L的三氟乙酸中,充N2密封,在121℃的條件下水解2h,冷卻后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除三氟乙酸,加水溶解繼續(xù)旋蒸直至無酸味,得扇貝內(nèi)臟多糖的單糖水解物。

稱取扇貝內(nèi)臟多糖(SVP)、肝素(HP)、硫酸軟骨素(CS)、透明質(zhì)酸(HA)、鮑魚性腺硫酸多糖(AGSP)各4mg,分別溶于1mL 1mol/L的三氟乙酸(TFA)中,充N2密封,在110℃的條件下水解3h,冷卻后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除三氟乙酸,加水溶解繼續(xù)旋蒸直至無酸味,得到含二糖片斷的水解物。

1.2.4.2 PMP衍生物的制備 各種水解物溶于2mL氨水中,混合標(biāo)準(zhǔn)單糖溶于5mL氨水中,分別取混合標(biāo)準(zhǔn)單糖和10種標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液100μL與100μL的PMP/甲醇溶液(0.3mol/L)混合,分別取SVP水解物200μL與200μL的PMP/甲醇溶液(0.3mol/L)混合,將所有混合液均放置在70℃下反應(yīng)30min。取出后冷卻至室溫,加入1.5mL純水,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氨水,重復(fù)2次。干燥后的物質(zhì)用1mL純水及1mL氯仿溶解,充分振蕩后除去有機(jī)相,重復(fù)3次,靜置,取上清液過0.22μm水相膜,用于HPLC-PAD-MS分析。

標(biāo)準(zhǔn)單糖甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、巖藻糖(Fuc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、氨基葡萄糖(GlcN)、氨基半乳糖(GalN)、核糖(Rib)、阿拉伯糖(Ara)(各10mg),也按照上述操作進(jìn)行衍生化,作為對(duì)照品使用。按照摩爾比為0.1mmol準(zhǔn)確稱取各單糖(不含Ara)作為單糖混合對(duì)照品,按照上述操作進(jìn)行衍生化。

1.2.4.3 HPLC-PAD-MS分析 儀器:配備電噴霧離子源(ESI)和光電二極管陣列檢測(cè)器(PDA)的LXQ線性離子阱質(zhì)譜儀,XCalibur軟件操作系統(tǒng)。

色譜條件:Silgreen ODS C18(250×4.6mm,5μm)色譜柱;柱溫30℃;流動(dòng)相20mmol乙酸銨-乙腈(78∶22,V/V);流速1mL/min。

質(zhì)譜條件:離子源ESI源;噴霧電壓4.5kV;毛細(xì)管溫度為275℃;毛細(xì)管電壓為37V;鞘氣:40AU;輔助氣:10AU;正離子模式檢測(cè);掃描方式為全掃描(Full Scan);掃描范圍為100～2000(m/z)。

2 結(jié)果與討論

2.1 SVP組分分析結(jié)果

SVP蛋白質(zhì)含量為4.09%,表明已經(jīng)基本去除了蛋白質(zhì)。中性糖含量較高,為75.37%。硫酸根含量為0.63%,硫酸多糖含量為8.77%。

2.2 SVP紅外光譜分析結(jié)果

SVP的紅外光譜如圖1所示,顯示了多糖的吸收特征。在3422cm-1處有強(qiáng)且寬的吸收峰,系多糖上的O-H的伸縮振動(dòng);2935cm-1附近的肩峰為飽和C-H伸縮振動(dòng)的信號(hào);1655cm-1處較強(qiáng)吸收,可能是C=O鍵的伸縮振動(dòng),或是酰胺鍵中N-H鍵的變角振動(dòng);1040cm-1處強(qiáng)吸收為C-O伸縮振動(dòng);1413cm-1處的吸收峰為硫酸基的特征吸收;而1250cm-1吸收峰可歸屬為-OSO3基團(tuán)的S=O伸縮振動(dòng)。

圖1 SVP紅外光譜Fig.1 IR spectrum of SVP

2.3 SVP單糖組成測(cè)定結(jié)果

圖2 SVP單糖PMP衍生物液相色譜圖。Fig.2 Chromatograms of PMP-labeled monosaccharides in SVP.注:圖A為紫外檢測(cè)器(245nm)色譜圖,圖B、C、D、E、F分別為提取m/z 510.23,511.21,481.20,495.22,525.19離子的色譜圖。

與薄層色譜法和氣相色譜法相比,PMP柱前衍生化液相色譜法分析復(fù)雜多糖單糖組成更為有效[8]。但是,使用HPLC-UV分析時(shí),常常會(huì)發(fā)生不同單糖PMP衍生物保留時(shí)間近似而難以區(qū)分的現(xiàn)象,另外,雜質(zhì)峰也會(huì)干擾指認(rèn)。本研究以HPLC-PAD-MS對(duì)單糖的PMP衍生物進(jìn)行檢測(cè),利用PAD和MS的定性作用,對(duì)色譜峰進(jìn)行定性辨別。在質(zhì)譜中,由于不同類型單糖的分子量不同,生成的PMP衍生物的準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比不同。氨基己糖(如GlcN和GalN)、己糖(如Man、Glc和Gal)、戊糖(如Ara,Rib和Xyl)、甲基戊糖(如Rha和Fuc)、己糖醛酸(如GlcA和GalA)PMP衍生物準(zhǔn)分子離子峰的理論質(zhì)荷比分別為510.23、511.21、481.20、495.22和525.19。

本實(shí)驗(yàn)是通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖保留時(shí)間、紫外光譜、質(zhì)譜信息進(jìn)行對(duì)比,指認(rèn)各色譜峰。如圖2所示,采用選擇離子方式,可以依據(jù)分子量差別分別顯示各類型單糖。但需要說明的是,該方法仍不能區(qū)分保留時(shí)間相同的同分異構(gòu)體,Ara和Xyl,而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道它們均大量存在于蝦夷扇貝內(nèi)臟多糖中[2,9]。最終,判斷SVP中的主要組成單糖是Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc,Ara,另外還含有少量的GlcN,GalN,GalA和Glc。其中,GlcN,GalN,GalA由于含量較少,在紫外色譜圖中難以分辨(圖2A),而質(zhì)譜技術(shù)提高了靈敏度(圖B和F)實(shí)現(xiàn)了檢出。這三種單糖常見于糖胺聚糖中,它們的存在提示扇貝內(nèi)臟可能存在糖胺聚糖,而糖胺聚糖的種類還需下步實(shí)驗(yàn)分析。

2.4 SVP種類的分析結(jié)果

在酸水解中,糖醛酸的糖苷鍵是最難斷裂的,因此,在較弱的酸水解條件下,可以產(chǎn)生非還原端為糖醛酸的二糖片段。本研究是通過鑒定多糖水解產(chǎn)生的二糖片段,間接推斷含糖醛酸多糖的種類。該方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。通過對(duì)SVP水解物的PMP-HPLC-PAD-MS分析,發(fā)現(xiàn)了四種二糖片段,它們的PMP衍生物分子離子峰質(zhì)荷比有兩種,m/z 686和m/z 687。

由分子離子峰m/z 686推測(cè)該二糖為糖醛酸與氨基己糖連接而成。而廣泛存在于扇貝組織中的糖胺聚糖[10-12]就是由糖醛酸與氨基己糖組成,包括肝素(HP),硫酸軟骨素(CS)和透明質(zhì)酸(HA)等。經(jīng)過酸水解,肝素將生成IdoA-(1→4)-GlcN,硫酸軟骨素將生成GlcA-(1→3)-GalN,透明質(zhì)酸將生成GlcA-(1→3)-GlcN,它們PMP衍生物的分子離子峰理論均為m/z 686.3。如圖3所示,選擇離子m/z 686.3得到的色譜圖中,SVP的二糖PMP衍生物的保留時(shí)間與硫酸軟骨素的一致,說明扇貝內(nèi)臟中可能存在硫酸軟骨素或其它可水解得該二糖片段的多糖。該二糖及其PMP衍生物結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖3 SVP(A),HP(B),CS(C)以及HA(D)降解物中二糖PMP衍生物的選擇離子m/z 686.3色譜圖Fig.3 Chromatograms of PMP-labeled disaccharides in SVP(A),HP(B),CS(C)and HA(D) with extracted ion at m/z 686.3

圖4 GlcA-(1→3)-GalN及其PMP衍生物的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structures of GlcA-(1→3)-GalN and its PMP derivative

由分子離子峰m/z 687推測(cè)該二糖為糖醛酸與己糖連接而成。如圖5A所示,選擇離子m/z 687.3獲得的色譜圖中可見三個(gè)色譜峰,說明扇貝內(nèi)臟中存在三種由糖醛酸與己糖重復(fù)二糖片段構(gòu)成的多糖。目前,對(duì)這種類型多糖的研究開發(fā)還較少,缺少商品化的標(biāo)準(zhǔn)品。本課題組前期從鮑魚性腺中分離得到的多糖(AGSP)主鏈結(jié)構(gòu)由GlcA-Man重復(fù)二糖片段構(gòu)成,酸水解可產(chǎn)生GlcA-(1→2)-Man,該二糖及其PMP衍生物結(jié)構(gòu)如圖6所示[13]。如圖5B所示,AGSP的二糖PMP衍生物的色譜峰對(duì)比,推測(cè)扇貝內(nèi)臟中存在AGSP或其它可水解得該二糖片段的多糖。

圖5 SVP(A)和AGSP(B)二糖衍生物選擇離子色譜圖。其中,提取的離子質(zhì)荷比為687.3Fig.5 Chromatograms of PMP-labeled oligosaccharides with extracted ions at m/z 687.3 in SVP(A)and AGSP(B)

圖6 GlcA-(1→2)-Man 及其PMP衍生物的結(jié)構(gòu)Fig.6 Structures of GlcA-(1→2)-Man and its PMP derivative

3 結(jié)論

SVP中蛋白質(zhì)含量為4.09%,中性糖含量為75.37%,硫酸根含量為0.63%,硫酸多糖含量為8.77%,紅外光譜中具有多糖特征吸收峰。采用PMP-HPLC-PDA-MS分析SVP的單糖組成,SVP中的主要組成單糖是Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc,Ara,另外還含有少量的GlcN,GalN,GalA和Glc。通過HPLC-PDA-MS對(duì)酸降解產(chǎn)物中二糖的分析,推測(cè)扇貝內(nèi)臟中存在硫酸軟骨素或其類似物、AGSP或其類似物以及另外兩種結(jié)構(gòu)中存在糖醛酸與己糖重復(fù)二糖片段的多糖,首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)蝦夷扇貝內(nèi)臟中多糖種類的鑒定。該方法是通過鑒定多糖酸水解產(chǎn)生的二糖片段來推斷含糖醛酸多糖的種類,避免了繁瑣的分離純化過程,使用樣品量較少,可在較短時(shí)間內(nèi)可獲得結(jié)果。這種鑒別多糖的方法未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究較為全面深入的提供了扇貝內(nèi)臟中多糖的信息,為開發(fā)利用扇貝內(nèi)臟提供了基礎(chǔ)的研究數(shù)據(jù)。

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Composition analysis of polysaccharides from viscus ofPatinopectenyessoensisby PMP-HPLC-MS

HUANG Lu,WANG Hong-xu,YIN Ting,CAO Jiu-ling,WEN Cheng-rong,SONG Shuang*

(School of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University,National Engineering Research Center of Seafood,Dalian 116034,China)

Polysaccharides were prepared from viscus ofPatinopectenyessoensis,and the contents of neutral sugar,protein,sulfate,sulfated polysaccharides were determined as 75.37%,4.09%,0.63% and 8.77%,respectively,by chemical methods. IR spectrum showed characteristic absorption of polysaccharides. Acid hydrolysates of the polysaccharides fromPatinopectenyessoensisviscus were analyzed by PMP-HPLC-PDA-MS. The results indicated that Xyl,Gal,Man,Rha,Fuc and Ara were the main components,whereas others,e.g. GlcN,GalN,GalA and Glc,were in a minor content. In addition,chondroitin sulfate or its analogue as well as three polysaccharides composed of a hexose and a hexuronic acid were found by analyzing the resulting disaccharides. This research provided information of polysaccharides in the scallop viscus,and helped to exploit and re-utilize this processing by-product.

Patinopectenyessoensis;viscus;polysaccharide;PMP-HPLC-MS

2014-11-05

黃璐(1989-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：海洋食品生理活性物質(zhì)。

*通訊作者:宋爽(1981-),女，博士，講師，研究方向：海洋天然產(chǎn)物研究。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301431)；遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(L2014222)；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃(2014002)；國(guó)家火炬計(jì)劃(2012GH560223)；國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)課題(2014AA093602)。

TS254.9

A

1002-0306(2015)07-0113-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.015