李文婷，曾志羽，桂 春，鄭慧蕾，李 靖，韋 恒，文 宏，黃偉強(qiáng)

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

Lewis大鼠急慢性期風(fēng)濕性心臟炎模型的比較

李文婷，曾志羽，桂 春，鄭慧蕾，李 靖，韋 恒，文 宏，黃偉強(qiáng)

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

目的比較3種急慢性期風(fēng)濕性心臟炎模型，找出理想的動(dòng)物模型。方法抗原Ⅰ、Ⅱ分別為滅活溶血性鏈球菌(GAS）與完全弗氏佐劑(CFA）、不完全弗氏佐劑(IFA）混合的乳化劑。Lewis雌鼠隨機(jī)分成四組：實(shí)驗(yàn)A、B、C組首次后足墊注射0．2 mL抗原Ⅰ，隨后分別注射抗原Ⅰ、Ⅱ、未滅活GAS免疫刺激建立模型，對(duì)照組D組分別對(duì)應(yīng)ABC組各6只，GAS替換為生理鹽水免疫刺激。于第7、12、24周末處死每組各6只，行血液生化及心臟HE染色檢查。結(jié)果 C組死亡率25%;A組心臟炎發(fā)生率最高，12周A、C組急性期損傷心肌、瓣膜彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)風(fēng)濕細(xì)胞聚集，較B組明顯;24周慢性期損傷A組瓣膜纖維化程度及比率較B、C組高;D組心肌、瓣膜均無病理改變。結(jié)論 A組CFA與GAS1：1混合乳化劑免疫大鼠5次，之后GAS連續(xù)刺激，能為急慢性期風(fēng)濕性心臟病的實(shí)驗(yàn)研究提供較好的可復(fù)制的動(dòng)物模型。

A族溶血性鏈球菌;Lewis大鼠;風(fēng)濕性心臟炎;風(fēng)濕性心臟病

風(fēng)濕熱由革蘭陽(yáng)性A組乙型溶血性鏈球菌(GAS）咽部感染所引起，長(zhǎng)期、反復(fù)發(fā)作的風(fēng)濕熱最終導(dǎo)致30% ～40%的病人嚴(yán)重并發(fā)癥風(fēng)濕性心臟病(RHD）的發(fā)生［1］。近年來在發(fā)展中國(guó)家和一些發(fā)達(dá)國(guó)家貧困地區(qū)，風(fēng)濕性心臟病的發(fā)病率、致殘率及致死率仍然較高［2］，給人們的生活和經(jīng)濟(jì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)［3－4］，但其發(fā)病機(jī)制和有效防治策略尚未完全明確，且目前沒有穩(wěn)定并能被廣泛應(yīng)用的風(fēng)濕性心臟病動(dòng)物模型供后續(xù)的研究。本研究采用三種造模方法對(duì)急慢性期風(fēng)濕性心臟炎成模率進(jìn)行比較，為RHD的實(shí)驗(yàn)研究提供較為理想的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

8周齡SPF級(jí)Lewis雌性大鼠78只，體重150～180 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京）2012－0001】，動(dòng)物飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心SPF(specific pathogen free，SPF）級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房【SYXK(桂）2014－0003】。完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑均購(gòu)自Sigam公司。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)、滅活

復(fù)蘇－20℃甘油中的A組乙型溶血性鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，接種于羊血平皿上，37℃培養(yǎng)48 h，見細(xì)菌生長(zhǎng)良好，刮取菌落接種于 1L腦心浸液(Biomerieux，法國(guó)）中，37℃，110 r/min快速震蕩培養(yǎng)24 h，4000 r/min，5 min離心收取細(xì)菌。滅菌生理鹽水洗滌3次，挑取細(xì)菌接種于羊血平皿培養(yǎng)，48 h后觀察無雜菌。均分細(xì)菌懸液，一份儲(chǔ)存于4℃，一份離心后于10 mL 40 g/L多聚甲醛溶液中滅活6 h，洗滌5次并再次挑取細(xì)菌接種于羊血平皿培養(yǎng)，48 h后觀察無細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.3 抗原制備

①配制目標(biāo)濃度細(xì)菌懸液：酶標(biāo)儀600 nm波長(zhǎng)檢測(cè)相應(yīng)滅活菌懸液OD值，根據(jù)公式Y(jié)(細(xì)菌總數(shù)）Y=51．102X(OD值）－3．931［5］檢測(cè)細(xì)菌懸液濃度(×108CFU/mL），并配置成濃度1×1011菌落形成單位(colonyforming unit，CFU）/mL懸液，置于冰中超聲破碎;②制備抗原：無菌條件下，滅活細(xì)菌懸液分別與弗氏完全佐劑(CFA）、弗氏不完全佐劑(IFA）按1∶1混合，超聲細(xì)胞破碎儀乳化(40%，4 mL，10 min）制備成抗原Ⅰ、抗原Ⅱ;取濃度為1× 1011CFU/mL活菌懸液即為抗原Ⅲ。

1.4 模型誘導(dǎo)方法

實(shí)驗(yàn)A、B、C組，對(duì)照組D組：A、B、C組各有大鼠18、18、24只，分別首次后足墊(掌面皮下）注射抗原Ⅰ0．2 mL。初次足墊部位免疫后，A、B組每周1次于腹部皮下注射抗原Ⅰ0．5 mL共4次，第5周A組(CFA組）給予滅活GAS，B組(IFA組）給予抗原Ⅱ，量及部位同前，C組(活菌組）每周1次于尾靜脈注射抗原Ⅲ(活菌）0．5 mL共4次，第5周始不予任何處理。對(duì)照組D組18只，每6只對(duì)應(yīng)各實(shí)驗(yàn)組，同樣方法注射，將GAS換成生理鹽水。

1.5 實(shí)驗(yàn)室檢查

觀察大鼠體征，分別于第7、12、24周末水合氯醛腹腔注射麻醉后解剖動(dòng)物，每次每組6只。取眼球后靜脈血測(cè)抗鏈球菌溶血素O(ASO）、類風(fēng)濕因子(RF）、超敏C－反應(yīng)蛋白(CRP），檢測(cè)方法采用免疫比濁法，試劑購(gòu)自上海執(zhí)誠(chéng)生物科技股份有限公司。取心臟于中性福爾馬林固定，按常規(guī)石蠟切片和HE染色，進(jìn)行病理觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x－±s）表示，統(tǒng)計(jì)軟件使用SPSS16．0，用單因素方差分析及兩獨(dú)立樣本資料的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C組24只，存活18只，死亡率25%，死亡大鼠不被列入觀察對(duì)象。初次免疫后，各組大鼠后足部出現(xiàn)紅腫熱，2周后消失，實(shí)驗(yàn)A、B、C組于之后的免疫過程中出現(xiàn)其它關(guān)節(jié)部位紅腫，未見畸形。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查

A、B、C、D各組大鼠第7、12、24周CRP均為陽(yáng)性，RF為陰性，各組檢測(cè)結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0．05）。A、B、D組各時(shí)間段ASO均為陰性，C組ASO第7、12周為陽(yáng)性，24周為陰性，較D組明顯增高(P＜0．05）(表1）。

2.3 心臟組織病理結(jié)果

D組心肌、瓣膜均未見有病理改變(表2及彩插5圖1）。A、B、C各組第7、12、24周心肌和瓣膜均有炎性改變，但發(fā)生率不同。A組心肌炎和瓣膜炎發(fā)生率均較其它組高(表2），7周各組心肌細(xì)胞間質(zhì)水腫，有散在淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見黏液樣變性(彩插6圖2a）。12周A、C組可見心肌及瓣膜彌漫性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(彩插6圖2b，c），心肌細(xì)胞間質(zhì)血管旁風(fēng)濕細(xì)胞聚集(彩插6圖2d），B組心肌及瓣膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度未及A、C組明顯，多呈散在分布，1只出現(xiàn)風(fēng)濕細(xì)胞聚集。24周A組6只中5只瓣膜纖維化(表2及彩插6圖2e，f），B、C組瓣膜纖維化不明顯。

表1 不同時(shí)間段四種免疫方法誘導(dǎo)大鼠各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查Tab．1 Laboratory results of rats induced by four immunity methods at different time periods

表2 不同時(shí)間段Lewis大鼠心肌炎和瓣膜炎發(fā)生率比較Tab．2 Comparation of incidence of myocarditis and valvulitis in Lewis rats at different time periods

3 討論

本研究中采用的Lewis大鼠屬近交系，具有高度純合，個(gè)體差異小，重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，而且對(duì)于自身免疫性疾病易感，此外，RHD患者多為女性，因此選擇雌性Lewis大鼠較適合于風(fēng)濕性心臟病動(dòng)物模型研究。大鼠首次接受免疫后足部紅腫熱，2周后消失，之后的實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)側(cè)后足部甚至前肢出現(xiàn)紅腫，無畸形，該體征與風(fēng)濕熱多發(fā)性關(guān)節(jié)炎有很大的相似度。CRP各組均為陽(yáng)性，主要考慮為皮下注射對(duì)大鼠自身的刺激所引起，RF均為陰性，此二者對(duì)風(fēng)濕熱的診斷不具特異性。C組ASO在第7、12周檢測(cè)為陽(yáng)性，第24周為陰性但較其它組增高，A、B組采用無活性GAS免疫未能引起ASO增高，而C組尾靜脈注射未滅活的GAS，在急性期ASO增高，非風(fēng)濕活動(dòng)期降低為陰性。僅從生化檢查分析，C組較為符合急慢性期風(fēng)濕性心臟炎發(fā)生發(fā)展結(jié)果。

風(fēng)濕病根據(jù)病變發(fā)展過程大致分為以下三期：變質(zhì)滲出期，增生期，瘢痕期。前二者屬于急性期心臟病理?yè)p傷，后者瘢痕期即心臟纖維化期屬于慢性期損傷。雖然在風(fēng)心病動(dòng)物模型制造方面國(guó)內(nèi)外有一些探索性的研究，但很少且不全面。Cunningham MW工作組［6］首次通過腹腔注射重組鏈球菌M6蛋白免疫Lewis大鼠，大鼠17 d后出現(xiàn)心臟炎，證實(shí)了Lewis大鼠誘導(dǎo)風(fēng)濕性心臟病的可行性，但是發(fā)生率較低。Lymbury RS等［7］用鏈球菌M5蛋白保守區(qū)肽段于Lewis大鼠上誘導(dǎo)出心瓣膜炎，但未見典型風(fēng)濕細(xì)胞。此兩種方法證實(shí)在誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性風(fēng)濕性心臟炎過程中M蛋白發(fā)揮的重要作用，但沒有考慮到 GAS抗原完整性的影響。Brimberg L等［8］用GAS抗原與CFA混合乳化劑成功誘導(dǎo)大鼠類似兒童鏈球菌感染后神經(jīng)系統(tǒng)損傷性舞蹈病。這一系列動(dòng)物模型驗(yàn)證了保持GAS抗原完整的重要性，風(fēng)心病的發(fā)生是因GAS抗原的長(zhǎng)久而持續(xù)的刺激所引起，所以對(duì)于以上造模方法需要進(jìn)行改良。本研究利用了鏈球菌抗原的完整性，A組即CFA組類似于余步云［9］的方法，但是增加了乳化劑腹部皮下免疫的次數(shù)，動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為滿意，7周處死的大鼠心肌組織見黏液樣變性，淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)呈散在或灶狀分部，發(fā)生心肌炎及瓣膜炎的概率為83．3%(5/6）、100% (6/6），12周發(fā)生心肌炎及瓣膜炎的概率均為100%，12周心肌間質(zhì)血管旁見風(fēng)濕細(xì)胞聚集，24周大鼠6只中有5只瓣膜纖維化，表明急慢性期風(fēng)濕性心臟炎已成功誘導(dǎo)。據(jù)報(bào)道CFA能夠促使大量IL17產(chǎn)生［10－11］，而IL17對(duì)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有很大影響［12］，從結(jié)果分析來看，加大佐劑CFA的刺激次數(shù)后，CFA組成模率已較余步云［9］大大提高，無論是急性期心肌炎及瓣膜炎的發(fā)生率，還是慢性期大鼠心臟瓣膜纖維化發(fā)生率及程度，并且較為符合臨床風(fēng)濕性心臟病的發(fā)展歷程。

此外，本研究 B組即 IFA組，于第4周給予GAS+CFA乳劑刺激之后，第5周開始每周持續(xù)給予GAS+IFA乳劑免疫Lewis大鼠，第7、12周處死的6只大鼠中4只出現(xiàn)心臟炎，但炎癥細(xì)胞呈散在分布，12周大鼠1只心肌間質(zhì)有類似風(fēng)濕細(xì)胞，24周大鼠2只發(fā)生少量瓣膜纖維化?；蛟S是因IFA能增加IL10大量分泌［10－11］，且Yang S等［13］的自身免疫心肌炎體外研究發(fā)現(xiàn)IL10使炎性細(xì)胞對(duì)心肌的浸潤(rùn)明顯減少，能有效抑制抗原呈遞和促炎因子釋放。持久的IFA與GAS乳化劑刺激未能引起心臟瓣膜明顯炎性改變，與IL10的大量分泌存在一定的關(guān)系。因此，B組并未能更好地誘導(dǎo)出動(dòng)物風(fēng)心病模型。

另外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用未滅活GAS來誘導(dǎo)風(fēng)濕性心臟病動(dòng)物模型，最早Unny SK等［14］采用皮內(nèi)注射溶血性鏈球菌，但是誘導(dǎo)出風(fēng)濕熱病變卻很少;之后宋志剛等［15］經(jīng)家兔耳緣靜脈注射GAS，并于GAS免疫后第二天肌注青霉素緩解家兔癥狀，但以上的探索均未能提高動(dòng)物風(fēng)心病的發(fā)生率。本研究實(shí)驗(yàn)C組中采用Lewis大鼠尾靜脈注射未滅活的GAS，血清ASO檢查利于A族溶血性鏈球菌感染的診斷，表明12周前存在風(fēng)濕熱活動(dòng)，病理結(jié)果心肌及瓣膜于各個(gè)時(shí)間段均有不同程度病變，病理變化結(jié)合血生化檢查結(jié)果提示此法誘導(dǎo)風(fēng)濕性心臟病模型是可行的。然而，該組大鼠死亡率25%，并且多于尾靜脈注射活菌后1 d死亡，主要考慮為溶血性鏈球菌急性感染所致，因此如何降低GAS急性感染死亡率，是否使用青霉素及其用量多少，這些問題均有待解決，因而此法尚不能作為風(fēng)心病造模方法首選。

綜上所述，A組完全弗氏佐劑與滅活GAS1：1混合超聲乳化后免疫大鼠5次，然后給予滅活的GAS連續(xù)刺激，該造模方法所誘導(dǎo)的風(fēng)濕性心臟病與人類該疾病相似度大，且成模率高，能為急慢性期風(fēng)濕性心臟病的實(shí)驗(yàn)研究提供較好的可復(fù)制的動(dòng)物模型。

［1］Guilherme L，F(xiàn)ae K，Oshiro SE，et al．Molecular pathogenesis of rheumatic fever and rheumatic heart disease［J］．Expert Rev Mol Med，2005，7：1－15．

［2］Marijon E，Mirabel M，Celermajer DS，et al．Rheumatic heart disease［J］．The Lancet，2012，379：953－964．

［3］Iung B，Vahanian A．Epidemiology of Acquired Valvular Heart Disease［J］．Canadian Journal of Cardiology，2014，30：962－970．

［4］Manjunath CN，Srinivas P，Ravindranath KS，et al．Incidence and patterns of valvular heart disease in a tertiary care highvolume cardiac center：a single center experience［J］．Indian Heart J，2014，66：320－326．

［5］羅映輝，鄔國(guó)軍，余俊龍，等．細(xì)菌繁殖與計(jì)數(shù)新方法的實(shí)驗(yàn)研究［J］．實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2003，10：828－829．

［6］Quinn A，Kosanke S，F(xiàn)ischetti VA，et al．Induction of autoimmune valvular heart disease by recombinant streptococcal m protein［J］．Infect Immun，2001，69：4072－4078．

［7］Lymbury RS，OliveC，PowellKA，etal．Induction of autoimmune valvulitis in Lewis rats following immunization with peptides from the conserved region of group A streptococcal M protein［J］．J Autoimmun，2003，20：211－217．

［8］Brimberg L，Benhar I，Mascaro－Blanco A，et al．Behavioral，Pharmacological， and Immunological Abnormalities after Streptococcal Exposure：A Novel Rat Model of Sydenham Chorea and Related Neuropsychiatric Disorders ［ J］．Neuropsychopharmacology，2012，37：2076－2087．

［9］Xie XJ，Zhou HJ，Huang JL，et al．An animal model of chronic rheumatic valvulitis induced by formalin－killed streptococci［J］．Rheumatology International，2010，30：1621－1625．

［10］Nikoopour E，Schwartz JA，Huszarik K，et al．Th17 Polarized Cells from Nonobese Diabetic Mice Following Mycobacterial Adjuvant Immunotherapy Delay Type 1 Diabetes［J］．Journal of Immunology，2010，184：4779－4788．

［11］Yoshizaki A，Yanaba K，Ogawa A，et al．Immunization With DNA Topoisomerase I and Freund’s Complete Adjuvant Induces Skin and Lung Fibrosis and Autoimmunity via Interleukin－6 Signaling［J］．Arthritis and Rheumatism，2011，63：3575－3585．

［12］Komiyama Y，Nakae S，Matsuki T，et al．IL－17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis［J］．Journal of Immunology，2006，177：566－573．

［13］Yang S，Li W，Liu W，et al．IL－10 gene modified dendritic cells induced antigen－specific tolerance in experimental autoimmune myocarditis［J］．Clin Immunol，2006，121：63－73．

［14］Unny SK，Middlebrooks BL．Streptococcal rheumatic carditis［J］．Microbiol Rev，1983，47：97－120．

［15］宋智鋼，劉維永，晏培松，等．實(shí)驗(yàn)性風(fēng)濕性心臟炎動(dòng)物模型的建立［J］．第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23：1853－1856．

A comparative study of different animal model of acute and chronic rheumatic carditis in Lewis rats

LI Wen－ting，ZENG Zhi－yu，GUI Chun，ZHENG Hui－lei，LI Jing，WEI Heng，WEN Hong，HUANG Wei－qiang
(The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

Objective To make comparisons of the three models of acute and chronic rheumatic carditis to find out an optimal animal model．Methods AntigenⅠwas a emulsifier mixed by complete freund’s adjuvant(CFA）and Group A streptococcus(GAS）．AntigenⅡwas mixed by incomplete freund’s adjuvant(IFA）and GAS．Female Lewis rats were randomly divided into four groups：A，B，C treatmeat groups were immuned with antigenⅠat the foot pad firstly．Subsequently，rats in group A、B、C were injected antigenⅠ，antigenⅡand activated GAS respectively to make the models of RHD．Rats in control group D were immunized with the same protocol outlined as treatment groups but without GAS．Respectively 7，12，24 weeks the rats were sacrificed 24(each group was 6）．The blood biochemical item and Hematoxylin－eosin(HE）staining of hearts were detected．Results In group C the mortality was 25%．In group A，the incidence of carditis was the highest．Histopathological manifestations of group A，C was not only revealed acute damage such as inflammatory cell infiltrate as well as group B，but also the Aschofflike cells in the myocardial cells interstitial．But in group A and C there had a great degree of the inflammatory cells infiltration than group B．At 24th week rats in group A detected the rate and degree of valve fibrosis in chronic damage were higher than group B and C．None of rats in group D presented carditis or valvulitis．Conclusion In group A，giving the GAS with continuous stimulation after using the mixedemulsification of CFA and GAS to immune Lewis rats for five times was a appropriate method which could provide an optimal animal model for experimental study of acute and chronic rheumatic heart disease．

Group A streptococcus;Lewis rat;Rheumatic carditis;Rheumatic heart disease

R－332

A

1671－7856(2015）07－0030－04

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．007

國(guó)家自然科學(xué)基金(81260067）。

李文婷(1988－），女，碩士生，專業(yè)：心血管內(nèi)科學(xué)。Email：lwt2010liebe@163．com。

曾志羽(1965－），男，主任醫(yī)師，研究方向：心血管疾病診治與研究。Email：zhiyuzeng@163．com。

2015－06－10