張 曼，施海霞，宋銘晶

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

微衛(wèi)星標(biāo)記在布氏田鼠封閉群遺傳結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用

張 曼，施海霞，宋銘晶

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

目的使用微衛(wèi)星標(biāo)記分析連續(xù)三代布氏田鼠封閉群遺傳結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。方法使用高鹽沉淀法從鼠尾中提取布氏田鼠基因組DNA，將篩選出7對微衛(wèi)星引物并用熒光標(biāo)記(Fam），然后對布氏田鼠封閉群連續(xù)三代的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序儀檢測PCR產(chǎn)物，整理原始數(shù)據(jù)并對布氏田鼠基因組DNA進(jìn)行微衛(wèi)星分析。結(jié)果 由平均有效雜合度和多態(tài)信息含量的分析得出該布氏田鼠種群傳代過程中保持著較高而且穩(wěn)定的雜合度。結(jié)論該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本實(shí)驗(yàn)室布氏田鼠封閉群的遺傳結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定。

布氏田鼠;封閉群;遺傳結(jié)構(gòu);微衛(wèi)星DNA標(biāo)記

2007年從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)引入了已在室內(nèi)隨機(jī)交配3年的布氏田鼠(Brandt’s vole，lasiopodomys brandtii）普通級實(shí)驗(yàn)室種群，在本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)繁殖3年，并對該種群進(jìn)行了系統(tǒng)藥物凈化和同胞選擇篩選。2011～2013年經(jīng)清潔級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物和寄生蟲學(xué)檢測達(dá)到了清潔級的標(biāo)準(zhǔn)［1］，到目前已建立了連續(xù)繁殖8代的清潔級布氏田鼠遠(yuǎn)交系(封閉群），同時(shí)2013年我們嘗試使用剖腹產(chǎn)凈化和SPF級ICR雌鼠代乳得到凈化的布氏田鼠仔鼠，剖腹產(chǎn)子代通過了SPF級的檢測，說明本實(shí)驗(yàn)室有繁育和凈化得到SPF級布氏田鼠的能力［2］。

封閉群遺傳結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定是該封閉群維持遺傳背景清晰和優(yōu)質(zhì)的必要條件，因此我們利用微衛(wèi)星標(biāo)記(simple sequence repeats，SSR）技術(shù)檢測布氏田鼠封閉群連續(xù)三代(F6～F8）的遺傳結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，分析布氏田鼠封閉群遺傳結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而推測在傳代中種群大小的變化，對等位基因多樣性的影響。最終，我們旨在通過SSR檢測和合理繁育配對建立經(jīng)濟(jì)高效的布氏田鼠封閉群的傳代體系。

SSR標(biāo)記是被廣泛應(yīng)用并為學(xué)者認(rèn)可的檢測不同動(dòng)物種群遺傳多態(tài)性的有效工具［3］，蔡磊等［4］檢測采集于廣東深圳大鵬灣淺水區(qū)的諸氏鯔蝦虎魚的平均多態(tài)信息指數(shù)(polymorphism information content，PIC）為0．447;安徽大學(xué)籠養(yǎng)的野外種群獼猴的平均PIC值為0．730［5］。而實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種群也利用PIC值作為其遺傳多態(tài)性的重要檢測指標(biāo)之一，李芳芳［6］等研究的兩個(gè)豚鼠封閉群(1994年引自日本，封閉至今;2004年引自Charles River）的平均PIC值為0．552;班建榮等［7］檢測引自蘭州公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室并連續(xù)封閉6年的SPF級KM小鼠封閉群PIC值為0．368～0．830;申幸嬌等人檢測來自北京三個(gè)單位的封閉群兔(SPF級日本大耳白兔，SPF級新西蘭白兔，SPF級青紫藍(lán)兔）平均PIC值為0．410、0．549、0．470［8］。但還未見有學(xué)者嘗試運(yùn)用SSR標(biāo)記檢測連續(xù)傳代的封閉群的遺傳穩(wěn)定性，從而探索將野生種群在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以最優(yōu)的繁育規(guī)模繁育，以實(shí)現(xiàn)該動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化，因此本實(shí)驗(yàn)為田鼠類動(dòng)物封閉群的建立和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級的布氏田鼠飼養(yǎng)在獨(dú)立送排風(fēng)凈化動(dòng)物籠(individually ventilated cage，IVC）中，飼養(yǎng)室溫度22℃ ～25℃，濕度50% ～70%，光照條件14L： 10D，自由攝食和飲水。動(dòng)物飲水、墊料和籠具均經(jīng)高壓滅菌處理，飼料經(jīng)CO60照射消毒達(dá)到SPF級動(dòng)物飼料標(biāo)準(zhǔn)。飼料生產(chǎn)許可證編號【SCXK(京） (2012、2013、2014）－0008】。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)批準(zhǔn)號，ILASPG－2014－011。

1．1．2 試劑與儀器

1．1．2．1 試劑

蛋白酶K(SIGMA公司）

Taq DNA聚合酶、10×PCR buffer(Mg2+）、dNTP、DNA Marker(20 bp）(TaKaRa）

膠回收試劑盒(BIOMIGA公司）

KAPA Taq HotStart擴(kuò)增試劑(KAPA公司）

1．1．2．2 儀器

7100型全自動(dòng)生化測定儀(日本日立公司產(chǎn)品），酶標(biāo)儀(Thermo），ROX－500分子量內(nèi)標(biāo)(北京閱微基因技術(shù)有限公司），BC－subMIDI電泳儀(北京六一儀器廠），JY300C電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），NAS－99分光光度計(jì)(ACTGene公司），BioSens SC 810B凝膠成像儀(上海山富科學(xué)儀器有限公司），GeneAmp 9600 PCR儀(ABI公司），3730XL DNA analyzer(ABI公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 DNA的提取

布氏田鼠基因組DNA來自連續(xù)三代的清潔級布氏田鼠幼仔(F6代50只，F(xiàn)7代36只，F(xiàn)8代40只，雌雄各半），采用高鹽沉淀法提取，具體步驟如下：取布氏田鼠尾部組織置于1．5 mL離心管中，加入500 μL鼠尾裂解液(Tris·HCL 10 mmol/L，Na2EDTA 0．1 mol/L，pH8．0配制）和10 μL蛋白酶K(20 mg/mL），55℃消化過夜，待鼠尾組織完全溶解僅有少許尾骨殘骸后，加入300 μL 6 mol/L飽和NaCL混勻，冰上靜置15 min，12000 r/min離心15 min后取上清，加入與上清等體積的異丙醇沉淀DNA，70%乙醇清洗兩次，然后倒掉乙醇自然風(fēng)干，200 μL TE溶解沉淀，分光光度計(jì)檢測DNA濃度，調(diào)整樣品濃度至10 ng/μL。

1．2．2 引物的篩選

隨機(jī)選取1只布氏田鼠基因組DNA用10條微衛(wèi)星DNA引物［9］進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用膠回收試劑盒回收目的片段后溶至30 μL無菌水中，取20 μL做基因組測序服務(wù)。根據(jù)測序結(jié)果篩選出與核心序列一致的7條引物，用帶有熒光標(biāo)記(Fam）的上游引物對布氏田鼠的基因組DNA進(jìn)行微衛(wèi)星分析。7個(gè)布氏田鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)及其特征描述見表1。

表1 7個(gè)布氏田鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)及其特征描述Tab．1 The primer and characteristics of 7 microsatellites loci for Brandt’s voles

1．2．3 PCR反應(yīng)條件及電泳

利用7對微衛(wèi)星引物對布氏田鼠基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：10×Buffer(Mg2+），1．5 μL;2．5 mmol/L dNTP，1．2 μL;上游和下游引物(5 μmol/L），1 μL;DNA Taq聚合酶(5 U/μL），0．1 μL;模板DNA，1 μL;3d H2O補(bǔ)齊至15 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95℃，5 min，1個(gè)循環(huán);然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，包括變性95℃，30 s;退火(各引物最適退火溫度），30 s，延伸72℃，30 s;最后延伸72℃，7 min;之后進(jìn)入4℃保存。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．2．4 3730 XL測序儀檢測

在96孔板中每孔加入分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液(0．5：8．5）9 μL，PCR產(chǎn)物1 μL，輕輕混勻后進(jìn)行上機(jī)檢測，95℃變性3 min。

1．2．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星引物擴(kuò)增及多態(tài)性

選取7個(gè)微衛(wèi)星座位檢測三代布氏田鼠封閉群的遺傳多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)DQ886927座位有12個(gè)等位基因，DQ886932座位有11個(gè)等位基因，DQ886926座位有10個(gè)等位基因，DQ886925座位有9個(gè)等位基因，具有豐富的多態(tài)性，DQ886929和DQ886930座位各有7個(gè)等位基因，DQ886934座位最少，為4個(gè)等位基因。7個(gè)微衛(wèi)星座位的平均等位基因數(shù)為8．57個(gè)。

2.2 雜合度和多態(tài)信息含量

三代布氏田鼠種群7個(gè)基因座位的觀測等位基因數(shù)(observed number of alleles）、Ho、He和PIC值見表2。由表2中可以計(jì)算出，F(xiàn)6代布氏田鼠種群7個(gè)不同座位的平均期望雜合度為0．606，F(xiàn)7代布氏田鼠種群 7個(gè)不同座位的平均期望雜合度為0．512，F(xiàn)8代布氏田鼠種群7個(gè)不同座位的平均期望雜合度為0．507。

3 討論

目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP和EST技術(shù)等。RFLP標(biāo)記為顯性遺傳，但對DNA多態(tài)性的檢出靈敏度不高;RAPD技術(shù)為顯性遺傳，不能識別雜合子位點(diǎn);AFLP技術(shù)對基因組純度和反應(yīng)條件要求較高［10－11］;SNP技術(shù)和EST技術(shù)多用于大規(guī)模的DNA序列檢測［12］。較之于上述5種分子標(biāo)記技術(shù)，微衛(wèi)星DNA分布廣泛，為共顯性標(biāo)記，具有較高的多態(tài)性和重復(fù)性，對DNA的濃度要求不高，可提供高分辨率的遺傳信息，適合于個(gè)體水平和種群水平上遺傳結(jié)構(gòu)的研究［13］。

表2 三代布氏田鼠種群7個(gè)基因座位的遺傳特點(diǎn)Tab．2 Genetic characterisitics of 7 microsatellite locus in three generations of Brandt’s voles

目前國內(nèi)沒有國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)作為指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物封閉群遺傳多樣性的建立和維持的規(guī)范。He和PIC值是評價(jià)種群遺傳多態(tài)性量化的主要指標(biāo)，一般He或PIC值越大，該基因座位雜合子的比例就越大，攜帶的遺傳信息量就越大。本研究中，7個(gè)微衛(wèi)星座位各自在連續(xù)三代的布氏田鼠種群傳代下的平均PIC和He值分別為DQ886925：0．606和0．652;DQ886926：0．507和0．538;DQ886927：0．669和0．699;DQ886929：0．306和 0．354;DQ886930： 0．385 和 0．412;DQ886932：0．672 和 0．702; DQ886934：0．350和0．434，說明本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)繁殖6代以上的布氏田鼠種群的平均PIC值在0．306～0．672，平均He值在0．354～0．702。同有關(guān)學(xué)者研究的種群的遺傳多態(tài)性相比較，如：C Marchi等［14］2007～2008年研究丹麥兩個(gè)農(nóng)業(yè)區(qū)域和一個(gè)自然區(qū)域的東方田鼠種群(He：0．671～0．835）、Magdalena Mikowska［15］2009年取自小島、大陸、重金屬污染區(qū)共10個(gè)地域的堤岸田鼠種群(He：0．578～0．869）、Claudia Melis等［16］2006年在挪威北部的14個(gè)水鼠種群(He：0．115～0．486）等，本實(shí)驗(yàn)室的布氏田鼠封閉群在實(shí)驗(yàn)室繁育規(guī)模較小的情況下，也沒有發(fā)生明顯的遺傳漂變。并且genepop4．2的 Hardy－Weinberg test分析得出三代布氏田鼠種群均達(dá)到平衡狀態(tài)，因此可以判定該群體在傳代過程中保持著合格封閉群的遺傳結(jié)構(gòu)。

總之，本研究表明該布氏田鼠封閉群在連續(xù)傳代過程中保持著穩(wěn)定的遺傳結(jié)構(gòu)和高度的遺傳多態(tài)性，該結(jié)論為我們建立最優(yōu)化的傳代體系提供了重要的理論支撐。鑒于目前國內(nèi)還沒有對封閉群的遺傳多樣性有指導(dǎo)性的要求，本研究在25對繁育籠的情況下，保持了該封閉群的遺傳多態(tài)的穩(wěn)定性，為田鼠類野生動(dòng)物的引種和繁育提供了借鑒。

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Applications of microsatellite marker technology in the genetic structure research for closed colony of Brandt’s voles

ZHANG Man，SHI Hai－xia，SONG Ming－jing
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China）

Objective Analysis of the genetic structure stability of Brandt’s vole(lasiopodomys brandtii）in closed colony using microsatellite marker technology．Methods Genomic DNA was extracted from tail tip using highconcentration－salt precipitation methods．Marked with fluorescent tags(Fam），7 microsatellite primers were filtered out by PCR，and the DNA structure of three consecutive generations of Brandt’s vole was analyzed by microsatellite marker．Results By the analysis of the average heterozygosity and polymorphism information content，Brandt’s vole populations maintaineda closed group of qualified genetic structure．Conclusions The present results show that the closed group of Brandt’s vole species in our laboratory maintain a stable genetic structure．

Brandt’s vole;Closed colony;Genetic structure;Microsatellite DNA marker

R－332

A

1671－7856(2015）07－0034－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．008

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301890）;北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(7122110）。

張曼(1989－），女，碩士生，研究方向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物學(xué)。E－mail：zh_man89@foxmail．com。

宋銘晶，博士，副研究員。E－mail：songmj@cnilas．org

2015－05－28）