董志會，王 衛(wèi)，叢 喆，熊圣文，駱 楊，陳 霆，魏 強

(北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

恒河猴BST-2基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性及其對蛋白結構和功能的影響

董志會，王 衛(wèi)，叢 喆，熊圣文，駱 楊，陳 霆，魏 強

(北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

目的篩查恒河猴BST-2基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(coding－region single nucleotide polymorphism，cSNP），研究其對蛋白結構和功能的影響。方法提取恒河猴外周血RNA，RT－PCR擴增，單克隆測序比對，確定猴BST-2的cSNP位點;通過蛋白質(zhì)結構分析軟件對蛋白結構進行分析;比較不同基因型猴體內(nèi)SHIVSF162p3復制水平的差異。結果 序列比對發(fā)現(xiàn)8個非同義突變位點;經(jīng)Psipred軟件預測，其中G41A、T128C、C129和A333C cSNP位點可影響B(tài)ST－2蛋白二級結構。在SHIVSF162p3感染平臺期，參考基因型猴(DLQ）病毒復制水平要高于GLQ型猴(P＜0．05），其他基因型猴之間無顯著差異。結論 cSNP(G41A）可能影響B(tài)ST－2的抗病毒功能，這為后續(xù)研究提供參考信息。

BST－2;cSNP;蛋白質(zhì)結構;恒河猴

骨髓基質(zhì)細胞抗原－2(bone marrow stromal cell antigen 2，BST－2），也稱tetherin，CD317或MH1．24，是近年來新發(fā)現(xiàn)的包膜病毒限制因子之一［1－2］。BST－2是一種具有特殊拓撲結構的脂筏相關跨膜蛋白，其通過連接病毒和宿主細胞膜，將新出芽病毒束縛在細胞膜表面，從而限制病毒的釋放［1］。有研究表明，其他天然抗病毒蛋白在與病毒協(xié)同進化的過程中，會出現(xiàn)某些位點核苷酸的突變，從而影響它們的抗病毒能力［1，3－4］;有文獻報道，人BST-2基因部分氨基酸殘基位點的改變可能影響HIV－1vpu對BST－2的敏感性［5］。但有關恒河猴BST-2基因多態(tài)性，及對蛋白結構和功能的影響尚未見報道。本研究旨在通過基因測序、序列比對、蛋白質(zhì)結構預測等技術找到恒河猴BST-2基因中影響抗SIV功能的cSNP位點，以及比較不同基因型猴艾滋病病毒復制的峰值與控制值，從而為后面探究猴BST－2抗病毒作用提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與樣品采集

中國恒河猴55只，購自北京協(xié)爾鑫生物資源研究所【SCXK(京）2005－2005】;分別采集動物外周血1 mL，EDTA抗凝，樣品采集后4 h內(nèi)提取RNA。

1.2 實驗動物病毒感染與指標測定

在實驗55只猴中選取20只恒河猴采取靜脈注射感染，感染病毒為SHIVSF162p3，毒力為300TCID50，在攻毒后3 d，7 d，10 d，后每隔7 d采集動物外周血1 mL，EDTA抗凝;樣品采集后4 h內(nèi)，分血漿，實時熒光定量PCR測血漿病毒載量，流式細胞術和血常規(guī)對全血進行分析。

1.3 外周血RNA的提取及反轉錄

實驗猴EDTA抗凝全血使用RNA BLOOD MINI KIT(購自QIAGEN公司）進行總RNA的提取，提取過程參照試劑盒說明書;提取RNA后立即對其進行反轉錄。

1.4 RT-PCR擴增

BST-2基因擴增采用兩步法，第一步使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大連）進行RT－PCR合成cDNA第一條鏈，操作過程參照試劑盒說明書;第二步用高保真酶KOD－Plus試劑盒(TOYOBO，上海）擴增BST-2基因，操作過程參照試劑盒說明書。BST-2基因引物來自參考文獻［6］，由 Invitrogene公司合成。引物序列為：F 5'－ATA ACT CGA GGT GGA ATT CAT GGC ACC TAT TTT GTA TGA C－3'，R 5'－ATA TTG GTA CCT CAC AGC AGC AGA GCG CTC AAG CCC AGC AGC AG－3'，退火溫度63℃。PCR在System 9700 PCR儀上進行(Applied Biosystems公司）

1.5 單克隆分型檢測

使用 QIAquick PCR Purification Kit(購自QIAGEN公司）對PCR產(chǎn)物進行純化回收，純化回收過程參照試劑盒說明書;對純化回收回來的DNA片段用DNA A－Tailing Kit(TaKaRa，大連）進行加A尾，加A尾過程參照試劑盒說明書;對加完A尾的DNA片段回收，與pMDTM18－T Vector進行連接，連接步驟參照pMDTM18－T Vector Cloning Kit(TaKaRa，大連）說明書;對連接好后的質(zhì)粒進行轉化，感受態(tài)細胞為 E．coli JM109 Competent Cells(TaKaRa，大連），轉化過程參考試劑盒說明書;轉化好后的感受態(tài)細胞放于1 mL無抗生素的SOS培養(yǎng)基中，在搖床上37℃，180 r/min培養(yǎng)1 h，然后從1 mL的菌液中抽取300 uL平鋪在帶有氨芐抗性的平板上，37℃恒溫培養(yǎng)16 h;待平板長出菌落，挑取菌落，進行菌落PCR，每個樣品選取6個陽性菌，送諾塞(北京）公司測序。

1.6 序列比對和生物軟件分析

DNA測序由北京諾賽基因公司完成。利用BioEdit軟件進行核苷酸和氨基酸序列比對，恒河猴［Macaca mulatta］ BST-2參考 cDNA 序列為： Transcript_id="NM_001161666．1";恒河猴［Macaca mulatta］BST－2氨基酸參考序列為：Protein_id="NP _001155138．1"。分別用 Psipred軟件，SWISSMODEL軟件進行蛋白質(zhì)二級和三級結構的預測。

2 結果

2.1 中國恒河猴BST-2基因編碼區(qū)cSNP位點的分布

提取20只恒河猴全血RNA，逆轉錄PCR后進行測序比對(參照序列為 NCBI上公布的 BST－2 cDNA序列，NM_001161666），一共找到9個突變位點，分別位于基因的胞質(zhì)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)(表1）;通過使用BioEdit軟件進行翻譯和氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)其中8個突變位點為非同義突變，在BST－2蛋白一級結構上的位置分別是：9(C/G），12(P/ S），14(D/G），29(I/V），43(L/P），111(Q/H），159(P/S）(圖1）。其中G9R，P12S，D14G分布在BST－2的胞質(zhì)區(qū);I29V，L43P分布在BST－2的跨膜區(qū)上;Q111H，P159S分布在BST－2的胞外區(qū)上。

圖1 恒河猴BST－2的蛋白質(zhì)結構及SNP分布情況Fig．1 Protein structure and SNP distribution in BST－2 of rhesus macaques

表1 恒河猴BST-2基因突變位點Tab．1 Nucleotide mutants of rhesus macaques

2.2 非同義cSNP對BST-2蛋白二級結構的影響

Psipred軟件分析結果顯示，3個非同義cSNP位點突變影響了BST－2蛋白的二級結構，具體分析，在13～15氨基酸殘基位置由一個無規(guī)則卷曲變成α螺旋，40～42氨基酸殘基由α螺旋轉變?yōu)闊o規(guī)則卷曲，111氨基酸殘基從原來的α螺旋轉變成無規(guī)則卷曲，其它結構均未發(fā)生變化(圖2）。

2.3 基因分型及cSNP位點的頻率測定

通過單克隆測序，用BioEdit軟件比對發(fā)現(xiàn)55只中國恒河猴中G41A基因頻率占2．17%;T128C的基因頻率為 22．5%;C129G的基因頻率為50%;A333C的基因頻率為5%。對基因分型結果進行分析，共找到了6種主要基因型(自然存在的）(表2）。

圖2 BST-2基因cSNP引起的蛋白二級結構變化Fig．2 The change of secondary structure caused by cSNP of BST-2

表2 恒河猴BST-2基因型及比率Tab．2 Genotypes of rhesus macaques’BST-2

2.4 不同基因型對猴艾滋病疾病進程的影響

經(jīng)過對不同基因型猴BST－2蛋白的二級結構預測，我們對這20只猴進行了基因型的分類，共分成了5群，分別是GLP(4只），DLQ(5只），DLQ/DPQ (4只），DLQ/GLQ(5只），DPH/DPQ(2只）。G/D是第14位氨基酸殘基類型，L/P是第43位氨基酸殘基類型，Q/H第111位氨基酸殘基類型。在這里，我們對不同基因型猴感染SHIVSF162p3之后病毒復制峰值和病毒復制控制值做了統(tǒng)計分析，統(tǒng)計方法采用單因素方差分析，通過Student－Newman－Keuls檢測，進行兩兩比較，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。從圖中我們可以看出，除了在病毒復制控制值上，DLQ型基因猴組高于GLQ型猴組有統(tǒng)計學差異外(P＜0．05），其他基因型猴組在病毒復制峰值和病毒控制值上兩兩之間均無統(tǒng)計學差異。具體來說，GLQ型與DLQ相比，DLQ型組峰值要高于GLQ;比較DLQ型和DLQ/DPQ型，DLQ組峰值和控制值要高于 DLQ/DPQ組;比較 DLQ/DPQ型和DPH/DPQ型，DLQ/DPQ型組與DPH/DPQ型組峰值差異不明顯，DLQ/DPQ組控制值要略高于DLQ/ DPQ組(圖3）。

圖3 不同BST-2基因型的病毒復制峰值和控制值Fig．3 The replication peak value and set－point value of different BST-2 genotype

3 討論

BST－2主要在未分化的B細胞，骨髓基質(zhì)細胞，樹突狀細胞等多種細胞中表達是一種典型的II型跨膜蛋白［7］。BST－2氨基端位于胞質(zhì)內(nèi)，隨后是一個α螺旋結構的跨膜蛋白域，胞外區(qū)也呈α螺旋結構，其羧基端有一個糖基磷脂酰肌醇錨定點［5］。BST－2不僅可以抑制免疫缺陷病毒的釋放，還可以抑制多重包膜病毒的釋放［7－8］，由此，我們可以看出BST－2具有廣泛的的抗包膜病毒釋放作用，因此，BST－2抗病毒的作用不可能是與病毒特異性的結合，2009年，Perez－Caballero年發(fā)現(xiàn)與BST－2具有相似拓撲結構的二聚體分子同樣具有束縛HIV－1的作用，表明是BST－2的拓撲結構而不是其一級結構氨基酸的序列起抗病毒作用［9］。現(xiàn)在，人們普遍認為，BST－2作為一個橋梁連接宿主細胞和病毒，從而把病毒粘連在宿主細胞表面，進而把一部分病毒內(nèi)吞降解。研究發(fā)現(xiàn)，不同病毒對BST－2的抗病毒作用有拮抗作用，如HIV－1vpu可以與人BST－2的跨膜區(qū)結合，從而誘導BST－2膜定位的轉移及降解［1］; SIV nef蛋白可以與猴BST－2的胞質(zhì)區(qū)氨基酸殘基結合，誘導降解BST－2［10］。比較人與恒河猴的BST－2蛋白一級結構，發(fā)現(xiàn)人BST－2胞質(zhì)區(qū)比猴的BST－2蛋白胞質(zhì)區(qū)少了5個氨基酸殘基，而這5個氨基酸殘基正是 SIVnef與猴 BST－2相互作用的關鍵部位［11］。Marina Laplana 2013年發(fā)現(xiàn)，不同的人BST－2基因型對艾滋病疾病進程具有一定的影響［12］。因此，有可能不同猴BST-2基因型對猴艾滋病疾病進展有影響。

由cSNP堿基序列的不同而產(chǎn)生的非同義突變會造成蛋白質(zhì)一級結構的變化，從而影響蛋白的高級結構。這種改變常常造成蛋白質(zhì)一些功能的變化。本研究主要找出猴BST-2非同義cSNP堿基序列的改變，通過蛋白二級結構預測和結合猴艾滋病疾病進程來分析這些 cSNP對猴 BST－2功能的影響。

在這里，我們發(fā)現(xiàn)了八個非同義cSNP位點，用Psipred軟件分析顯示，只有三個cSNP位點的改變對猴BST－2的二級結構產(chǎn)生了影響，尤其是第14為G/D的變化使得猴BST－2胞質(zhì)區(qū)的一小段α螺旋得以延伸，而第14，15，16，17，18，19位這幾個氨基酸殘基正是SIV nef的結合關鍵位點，而其他兩個cSNP位點的改變雖對BST－2的二級結構產(chǎn)生了一些變化，但是用SWISS－MODEL軟件分析發(fā)現(xiàn)，這兩個cSNP對猴BST－2的三級結構幾乎沒有影響，而且在BST－2是以其獨特的拓撲結構來發(fā)揮其抗病毒作用，因此這兩個cSNP對BST－2的功能可能不會有太大影響。在不同基因型猴艾滋病疾病進程的比較中，DLQ型峰值和控制值要高于GLQ型，DLQ型峰值和控制值要高于DLQ/DPQ型，DLQ/DPQ型與DPH/DPQ型峰值差異不明顯，DLQ/DPQ型控制值要略高于DLQ/DPQ型，這些說明了猴BST－2蛋白在第14位，第43位氨基酸殘基分別是G和P時，有可能可以增強其抗病毒作用，而111位氨基酸殘基的變化可能對猴BST－2抗病毒作用并無影響。在這里我們需要提出的是，艾滋病是一個極其復雜的病毒感染性疾病，有很多因素影響著其疾病進程，因此，我們還需要進一步實驗驗證這些位點與猴BST－2蛋白抗病毒作用有關。

本實驗為進一步研究猴BST－2蛋白功能提供一定參考依據(jù)，為病毒拮抗該蛋白的機制研究提供參考。下一步，我們將在細胞實驗上去驗證這3個cSNP位點對猴BST－2抗病毒作用的影響。

［1］STUART J N，ZANG T，BIENIASZ P D．Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV－1 Vpu［J］．Nature，2008，451(7177）：425－430．

［2］VAN DAMME N，GOFF D，KATSURA C，et al．The interferoninduced protein BST－2 restricts HIV－1 release and is downregulated from the cell surface by the viral Vpu protein［J］．Cell Host Microbe，2008，3(4）：245－252．

［3］ MCEWAN WA，SCHALLER T，YLINEN LM，et al．Truncation of TRIM5 in the feliformia explains the absence of retroviral restriction in cells of the domestic cat［J］．Virol，2009，83 (16）：8270－8275．

［4］ ROLLASON R，KOROLCHUK V，HAMILTON C，et al．Clathrin－mediated endocytosis of a lipid－raft－associated protein is mediated through a dual tyrosine motif［J］．Cell Sci，2007，120 (Pt 21）：3850－3858．

［5］KUPZIG S，KOROLCHUK V，ROLLASON R，et al．Bst－2/ HM1．24 is a raft－associated apical membrane protein with an unusual topology［J］．Traffic，2003，4(10）：694－709．

［6］YOSHIDA T，KAO S，STREBEL K．Identification of residues in the BST－2 TM domain important for antagonism by HIV－1 VPU using a Gain－of－Function approach［J］．Front Microbiol，2011，2：35．

［7］ISHIKAWA J，KAISHO T，TOMIZAWA H，et al．Molecular cloning and chromosomal mapping of a bone marrow stromal cell surface gene，BST2，that May be involved in pre－B－cell growth［J］．Genomics，1995，26(3）：527－534．

［8］JOUVENET N，NEIL SJ，ZHADINA M，et al．Broad－spectrum inhibition of retroviral and filoviral particle release by tetherin［J］．J Virol，2009，83(4）：1837－1844．

［9］PEREZ－CABALLERO D，ZANG T，EBRAHIMI A，et al．Tetherin inhibits HIV－1 release by directly tethering virions to cells［J］．Cell，2009，139(3）：499－511．

［10］ZHANG F，WILSON SJ，LANDFORD WC，et al．Nef proteins from simian immunodeficiency viruses are tetherin antagonists［J］．Cell Host Microbe，2009，6(1）：54－67．

［11］ EVANS DT，SERRA－MORENO R，SINGH RK，et al．BST－2/ tetherin：a new component of the innate immune response to enveloped viruses［J］．Trends Microbiol，2010，18(9）：388－396．

［12］LAPLANA M，CARUZ A，PINEDA JA，et al．Association of BST－2 gene variants with HIV disease progression underscores the role of BST－2 in HIV type 1 infection［J］．Infect Dis，2013，207(3）：411－419．

Polymorphisms of coding region in BST-2 gene of Rhesus macaques and their effects on protein structure and function

DONG Zhi－h(huán)ui，WANG Wei，CONG Zhe，XIONG Sheng－wen，LUO Yang，CHENG Ting，WEI Qiang
(Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College(PUMC）＆Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS）;Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health; Key Laboratory of Human Diseases Animal Models，State administration of Traditional Chinese medicine，Beijing 100021，China）

Objective To explore the impacts of cSNP on the structure and function of rhesus macaque’s BST－2．Methods Extracting RNA from peripheral blood of rhesus macaques，then RT－PCR，Monoclonal sequencing to find the cSNP sites;Forecasting the structure of these proteins;Comparing the Level of SIVmac239 replication between the different genotypic Rhesus macaques．Results We found 8 non－synonymous mutation sites，in the 8 non－synonymous mutation sites，Only G41A，T128C，C129 and A333C change the secondary protein structure of BST－2 by forecasting of Psipred software;At the plateau of SHIVSF162p3 replication，The SHIVSF162p3 replication level of reference genotype rhesus macaque(DLQ）is higher than rhesus macaques of GLQ genotype，other genotypes rhesus macaques have no significant difference．Conclusion cSNP(G41A）may influence the antiviral activity of rhesus macaque’s BST－2，this study gives us a reference to further research work．

BST－2;cSNP;Structure;Rhesus macaque

魏強(1964－），男，教授，博士生導師，研究方向：實驗動物病毒學。E－mail：weiqiang0430@sohu．com。

R－332

A

1671－7856(2015）07－0020－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．005

“十二五”傳染病重大專項課題(2012ZX10004－501－001;2013ZX10004－608－003）

董志會(1988－），男，碩士生，專業(yè)：比較醫(yī)學。

2015－06－10