覃春美，劉 琦，李 瑩，甘林望，劉 建，歐三桃

(瀘州醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院 腎病內(nèi)科，四川 瀘州646000)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床常見(jiàn)的危急重癥，其發(fā)病率逐年上升，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。由內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)所導(dǎo)致的膿毒癥是引起AKI的常見(jiàn)病因[1]。c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)信號(hào)通路作為促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路的重要通路之一，參與了細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞骨架構(gòu)建、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞惡變等多種生物學(xué)反應(yīng)。既往研究發(fā)現(xiàn)多種腎臟疾病如梗阻性腎病、缺血性腎病、高血壓腎病及糖尿病腎病[2-5]等均存在JNK信號(hào)通路的激活。然而JNK信號(hào)通路在AKI 腎組織中的激活情況以及與AKI 等腎臟疾病關(guān)系的研究罕見(jiàn)報(bào)道。本研究采用LPS 誘導(dǎo)的AKI 小鼠模型，觀察腎臟中JNK信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步了解JNK 通路激活在AKI 發(fā)病過(guò)程中的重要作用和可能涉及的機(jī)制，為臨床防治膿毒血癥所致的AKI 提供新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)雄性小鼠(C57B1/6J)48只，體質(zhì)量25～30 g[瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SYXK(川2013-065)];LPS 和α-tubulin 抗體(Sigma 公司);兔抗小鼠p-JNK 多克隆抗體和兔抗小鼠p-c-Jun單克隆抗體(San Diego 公司);生物素化羊抗兔IgG(Carlsbad公司);即用型ABC 試劑盒(武漢博士德公司);腫瘤壞死因子α ELISA 試劑盒(R＆D Systems 公司);白細(xì)胞介素1β ELISA 試劑盒(Leinco 公司)。

1.2 方法

1.2.1 AKI 模型的制備:將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和AKI組，每組24只，AKI組按LPS 5 mg/kg 一次性腹腔注射給藥。正常對(duì)照組腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)，腹腔注射前禁食，自由飲水。分別于給藥后1、2、4 和30 h 處死小鼠，采血及取腎組織標(biāo)本(每組各6 只)。左腎部分組織固定于4%中性多聚甲醛液，經(jīng)脫水、透明和包埋，制成腎組織石蠟塊，其余腎組織凍存于－80℃冰箱中備用。

1.2.2 腎功能及腎臟病理檢測(cè):用7600 全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)血清胱抑素C(Cys C)水平，腎組織經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，行HE染色鏡下觀察腎組織病理改變。

1.2.3 免疫組化觀察p-JNK 和p-c-Jun蛋白表達(dá):按照免疫組化試劑盒說(shuō)明，采用ABC 法，石蠟切片脫蠟至水后，熱修復(fù)抗原，山羊血清封閉非特異性抗原，依次滴加一抗、二抗、ABC 復(fù)合物，DAB 顯色后脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)p-JNK 和p-c-Jun蛋白水平:每一樣本稱取腎組織50 mg，用Urea RIPA 裂解緩沖液勻漿腎組織，4℃12 000 r/min 離心15 min，取上清為樣本，Bradford 方法測(cè)定蛋白濃度，每孔取40 μg 蛋白上樣，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，浸入封閉液室溫孵育60 min。加抗p-JNK 抗體(或抗p-c-Jun抗體)一抗4℃冰箱過(guò)夜，加入熒光標(biāo)記的羊抗兔抗體37℃孵育1 h，用ECL 探測(cè)顯影。以α-tubulin為內(nèi)參照，用Image J 軟件對(duì)吸光度值進(jìn)行定量分析。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)血TNF-α 和IL-1β水平:按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血TNF-α 和IL-1β水平，每份標(biāo)本重復(fù)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腎功能及腎臟病理檢測(cè)

與對(duì)照組相比較，AKI組小鼠于注射LPS 2 h后BUN、Scr 和Cys C 即開(kāi)始明顯上升，在30 h時(shí)升高最明顯(圖1)。注射LPS后，AKI組腎組織2 h時(shí)可見(jiàn)腎小管輕度擴(kuò)張，腎小管空泡樣變，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，4 h時(shí)可見(jiàn)腎小管擴(kuò)張更明顯，部分腎小球腫脹，腎間質(zhì)可見(jiàn)炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤(rùn);30 h時(shí)腎臟損傷進(jìn)一步加重，偶可見(jiàn)部分腎小管上皮細(xì)胞凋亡、空泡樣變，甚至壞死(圖2)。

2.2 免疫組化結(jié)果

對(duì)照組腎組織中p-JNK 和p-c-Jun 在腎小球及腎小管有散在微量表達(dá)。AKI組小鼠腎組織中可見(jiàn)p-JNK 和p-c-Jun 在1 h時(shí)表達(dá)開(kāi)始明顯增加，陽(yáng)性著色較深，胞質(zhì)胞核呈大量棕黃色，主要分布于腎小球足細(xì)胞、近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、集合管、腎血管等部位，隨時(shí)間進(jìn)展表達(dá)逐漸增強(qiáng)，以4 h表達(dá)最強(qiáng)，30 h時(shí)p-JNK 和p-c-Jun表達(dá)顯著下調(diào)(圖3)。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)血清尿素氮、肌酐和胱抑素C水平Fig1 The level of BUN，Scr and Cys C at different time points(±s，n=6)

圖2 小鼠腎臟蘇木精-伊紅染色組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)Fig2 Histomorphological characteristics of kidney sections of mice(×400)

圖3 免疫組化檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)p-c-Jun的表達(dá)Fig3 Expression of p-c-Jun at different time points detected by IHC(×200)

2.3 Western blot

注射LPS 1 h后p-JNK蛋白含量顯著升高，于4 h達(dá)峰值，以后逐漸下降，30 h時(shí)p-JNK蛋白水平明顯下降(圖4)。p-c-Jun 在LPS 作用1 h時(shí)已明顯上調(diào)，4 h達(dá)峰值后逐漸下降，30 h時(shí)與對(duì)照組無(wú)差異(圖5)。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)p-JNK的表達(dá)Fig4 Protein expression of p-JNK at different time points

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)p-c-Jun的表達(dá)Fig5 Protein expression of p-c-Jun at different time points

2.4 血清TNF-α、IL-1β的檢測(cè)結(jié)果

小鼠注射LPS后1 h 血清TNF-α、IL-1β水平均較對(duì)照組升高，4 h 達(dá)峰值后逐漸下降，且30 h時(shí)仍明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)(圖6)。

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)血清TNF-α 和IL-1β的含量Fig6 The level of TNF-α and IL-1β at different time points(±s)

3 討論

AKI是危重癥患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而危重患者AKI 最常見(jiàn)的病因?yàn)槟摱景Y休克、心源性休克、創(chuàng)傷以及藥物中毒[6]。近來(lái)一個(gè)臨床研究報(bào)道，在ICU 病房中，50%的AKI 患者由膿毒癥所致[7]。LPS是革蘭陰性細(xì)菌外膜上的主要成分，可以啟動(dòng)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥甚至膿毒癥休克和多器官功能障礙綜合征。本研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射LPS 可導(dǎo)致小鼠迅速出現(xiàn)腎功能不全及腎組織病理?yè)p傷，成功誘導(dǎo)小鼠內(nèi)毒素性AKI 模型。

JNK 又叫應(yīng)激激活蛋白激酶，是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要通路之一，可被多種細(xì)胞應(yīng)激如(氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)因子)等激活，被活化后可磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子及其他蛋白激酶，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和凋亡等多種病理生理過(guò)程[8]。既往研究表明，JNK信號(hào)通路激活與腎臟疾病關(guān)系密切。用H2O2刺激小鼠腎小球系膜細(xì)胞，可使p-JNK的表達(dá)上升，并使活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成增多，導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞的損傷和凋亡[9];觀察JNK 在單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)模型大鼠中的表達(dá)情況，結(jié)果UUO 組p-JNK的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，認(rèn)為梗阻性腎病中存在JNK信號(hào)通路的激活[2]。本研究用LPS 誘導(dǎo)內(nèi)毒素性AKI，研究結(jié)果顯示p-JNK和p-c-Jun 在正常小鼠腎臟組織中僅有極少量表達(dá)，而在AKI 模型中，p-JNK 及p-c-Jun 在腎小球、腎小管區(qū)域的表達(dá)明顯升高，p-JNK 和p-c-Jun蛋白水平在注射LPS 1 h時(shí)已顯著上調(diào)，于4 h達(dá)峰值后逐漸下降，30 h時(shí)接近正常水平。上述結(jié)果表明在AKI的極早期就存在JNK 通路的明顯激活，p-JNK及p-c-Jun 在AKI 小鼠腎臟的變化與LPS的刺激有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)不但小鼠AKI 模型腎組織中p-JNK 和p-c-Jun 較正常對(duì)照組明顯升高，血中TNF-α 和IL-1β水平也顯著升高，且其動(dòng)態(tài)變化與JNK的變化規(guī)律呈一致性，表明膿毒癥時(shí)促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β的升高與JNK的活化明顯相關(guān)。既往研究也證實(shí)，JNK 和c-Jun的表達(dá)可影響炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，LPS 刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α 和IL-1β 等促炎反應(yīng)因子與p-JNK 和p-c-Jun的激活有密切關(guān)系[10]。以上資料充分提示JNK信號(hào)通路激活可誘發(fā)TNF-α 和IL-1β 等炎性反應(yīng)因子的釋放，繼而介導(dǎo)AKI的發(fā)生發(fā)展。

總之，C57B1/6J 小鼠腹腔注射LPS 致內(nèi)毒素性AKI 模型中存在JNK 通路的激活，且參與了AKI的發(fā)生發(fā)展，提示JNK信號(hào)通路激活在LPS 誘導(dǎo)的小鼠AKI 發(fā)病中起重要作用。JNK信號(hào)通路有望成為內(nèi)毒素介導(dǎo)AKI的新的治療靶點(diǎn)，了解其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律有利于選擇最佳時(shí)機(jī)對(duì)其阻斷和干預(yù)。

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