郭冰冰，路 明，李文杰

(徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 兒科，江蘇 徐州221000)

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)主要由心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFb)的過度增殖、大量合成和分泌基質(zhì)蛋白及膠原纖維所致。近來發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK信號通路與多種心血管疾病，如慢性心力衰竭、高血壓和動脈粥樣硬化等密切相關(guān)[1]，但其在CFb 增殖及心肌纖維化中的作用還缺乏深入研究。法舒地爾(Fasudil，F(xiàn)as)是唯一應(yīng)用于臨床的Rho 激酶特異抑制劑，臨床發(fā)現(xiàn)其可改善高血壓及心力衰竭患者的心功能。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用血管緊張素Ⅱ(angiotensin，Ang Ⅱ)誘導(dǎo)大鼠CFb的增殖及膠原合成，模擬心肌纖維化的病理過程，探討Fas 抑制心肌纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑:清潔級1～3 d的SD大鼠[徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，SCXK(蘇)2013-003]。Ang Ⅱ、四甲基偶氮唑鹽(MTT)(Sigma 公司);DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco 公司);兔抗大鼠波形蛋白單克隆抗體(武漢博奧森公司);羥脯氨酸試劑盒(南京建成公司);結(jié)締組織生長因子(CTGF)一抗、總RNA 提取試劑(Trizol)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司);法舒地爾注射液(天津紅日藥業(yè)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 CFb的培養(yǎng)與鑒定:采用胰蛋白酶消化法及差速貼壁法培養(yǎng)CFb，置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫熒光波形蛋白染色鑒定CFb。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組:細(xì)胞隨機(jī)分為5 組:1)對照組;2)Ang Ⅱ組:AngⅡ1×10－6mol/L;3)AngⅡ+Fas 低劑量(25 μmol/L);4)Ang Ⅱ+Fas 中劑量組(50 μmol/L);5)Ang Ⅱ+Fas 高劑量組(100 μmol/L)。

1.2.3 MTT 比色法檢測細(xì)胞增殖:按照MTT 比色法步驟進(jìn)行操作。

1.2.4 羥脯氨酸法檢測CFb 膠原含量:嚴(yán)格按照羥脯氨酸試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 RT-PCR檢測RhoA 及ROCK mRNA:常規(guī)提取細(xì)胞總RNA 和反轉(zhuǎn)錄，定量PCR擴(kuò)增目的基因。

1.2.6 Western blot檢測CTGF蛋白水平:三去污法提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，凝膠圖像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)間比較應(yīng)用One-way ANOVA 分析。

2 結(jié)果

2.1 心肌成纖維細(xì)胞的鑒定:CFb 呈梭形或不規(guī)則三角形，細(xì)胞核較大呈橢圓形，胞質(zhì)透明，抗波形蛋白單克隆抗體免疫熒光染色為陽性(圖1)。

圖1 CFb的細(xì)胞鑒定圖Fig1 The identification of CFb cells

2.2 不同濃度Fas 對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFb 增殖和膠原合成的影響:Ang Ⅱ組細(xì)胞增殖及膠原合成量顯著高于對照組(P＜0.05)，而Fas 中、高劑量干預(yù)組使其明顯下降(P＜0.05)(表1)。

2.3 Fas 對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFb 中RhoA 及ROCK mRNA表達(dá)的影響:Ang Ⅱ組RhoA 及ROCK mRNA表達(dá)量顯著高于對照組(P＜0.01)，而Fas 中、高劑量干預(yù)組使其明顯下降(P＜0.01)(圖2，表2)。

表1 不同濃度Fas 和1×10 －6 mol/L Ang Ⅱ?qū)Fb的增殖及膠原合成的影響Table1 Effects of Fas and 1×10 －6 mol/L Ang Ⅱon the proliferation and collagen synthesis of CFb(±s，n=6)

表1 不同濃度Fas 和1×10 －6 mol/L Ang Ⅱ?qū)Fb的增殖及膠原合成的影響Table1 Effects of Fas and 1×10 －6 mol/L Ang Ⅱon the proliferation and collagen synthesis of CFb(±s，n=6)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with Ang Ⅱgroup.

group A value collagen synthesis control 0.29±0.02 1.38±0.13 Ang Ⅱ 0.38±0.02* 1.79±0.10*Fas 25 μmol/L+Ang Ⅱ 0.36±0.03 1.65±0.11 Fas 50 μmol/L+Ang Ⅱ 0.35±0.02# 1.56±0.10##Fas 100 μmol/L+Ang Ⅱ 0.33±0.01## 1.52±0.09##

圖2 各組心肌成纖維細(xì)胞RhoA 和ROCK mRNA的表達(dá)Fig2 The expression of RhoA and ROCK mRNA in different groups

2.4 Fas 對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的CFb 中CTGF蛋白表達(dá)的影響:Ang Ⅱ組CTGF蛋白表達(dá)顯著高于對照組(P＜0.01)，而Fas中、高劑量干預(yù)組使其明顯下調(diào)(P＜0.01)(圖3，表2)。

表2 各組心肌成纖維細(xì)胞RhoA、ROCK mRNA 和CTGF蛋白的表達(dá)Table2 Expression of RhoA，ROCK mRNA and CTGF protein in different groups (±s，n=6)

表2 各組心肌成纖維細(xì)胞RhoA、ROCK mRNA 和CTGF蛋白的表達(dá)Table2 Expression of RhoA，ROCK mRNA and CTGF protein in different groups (±s，n=6)

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.05 compared with AngⅡgroup.

group ROCK mRNA RhoA mRNA CTGF protein control 0.46±0.07 0.37±0.12 0.53±0.10 Ang Ⅱ 1.53±0.12* 1.28±0.10 1.49±0.16*Fas 25 μmol/L+Ang Ⅱ 1.47±0.09 1.12±0.06 1.36±0.16 Fas 50 μmol/L+Ang Ⅱ 0.85±0.10# 0.68±0.09b 0.77±0.08#Fas 100 μmol/L+Ang Ⅱ 0.69±0.08# 0.57±0.08b 0.65±0.10#

圖3 各組心肌成纖維細(xì)胞CTGF的蛋白表達(dá)量Fig3 The expression of CTGF protein in different groups

3 討論

CFb是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，Ang Ⅱ誘導(dǎo)CFb 增殖的作用已得到公認(rèn)[2]。Fas是Rho 激酶特異抑制劑，其逆轉(zhuǎn)心肌纖維化的具體機(jī)制尚不明確。

研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK 通路參與調(diào)控心肌肥大及CFb增殖凋亡，并在肝、腎、肺等臟器的慢性纖維化中異?；罨捅磉_(dá)。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是體內(nèi)最重要的促纖維化細(xì)胞因子TGF-β的直接下游效應(yīng)介質(zhì)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)沉積等多種生物學(xué)效應(yīng)。Rho 激酶作為一個分子開關(guān)對TGF-β/ CTGF 基因調(diào)控起關(guān)鍵作用[3]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ作用于CFb后，Rho/ROCK 通路被活化，繼而CTGF表達(dá)上調(diào)。當(dāng)Rho/ROCK 通路被Fas 特異性阻斷后，CTGF的表達(dá)明顯減少，CFb 增殖及膠原合成受到抑制。

綜上所述，F(xiàn)as 可通過抑制RhoA/ROCK 通路及其下游CTGF的表達(dá)抑制CFb的增殖，并在一定的范圍內(nèi)呈劑量依賴性。

[1]Parajuli N，Ramprasath T，Patel VB，et al.Targeting angiotensin-converting enzyme 2 as a new therapeutic target for cardiovascular diseases[J].Can J Physiol Pharmacol，2014，92:558-565.

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[3]Sakai K，Jawaid S，Sasaki T，et al.Transforming growth factor-beta-independent role of connective tissue growth factor in the development of liver fibrosis[J].Am J Patholv，2014，184:2611-2617.