邵榮學，全仁夫，張 亮，謝尚舉，楊迪生，韋習成

（1.浙江中醫(yī)藥大學，杭州 310053；2.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院骨科，杭州 311200；3.浙江大學附屬第二醫(yī)院骨科，杭州 310009；4.上海大學材料科學與工程學院，上海 200072）

梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料在松質骨缺損應用的實驗

邵榮學1，全仁夫2，張 亮2，謝尚舉2，楊迪生3，韋習成4

（1.浙江中醫(yī)藥大學，杭州 310053；2.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院骨科，杭州 311200；3.浙江大學附屬第二醫(yī)院骨科，杭州 310009；4.上海大學材料科學與工程學院，上海 200072）

目的評估新型梯度復合HA/ZrO2（羥基磷灰石/二氧化鋯）多孔支架材料在修復比格犬椎體骨缺損的效果。方法（1）采用泡沫海綿體浸漬成型法、聯(lián)合梯度復合及高溫燒結法制備新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料；（2）將18只普通級比格犬（體重10～13kg、5～8月齡、雌雄不拘）隨機分成2組（A組12只、B組6只），通過手術復制椎體骨缺損模型，A組予以植入梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料、B組植入自體髂骨；（3）術后進行影像學檢查、形態(tài)學觀察及生物力學測試，并比較新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料與自體髂骨對修復比格犬椎體缺損的效果。結果（1）新型HA/ZrO2多孔支架材料孔隙率為25ppi（每英寸25個孔）、孔隙均勻，孔徑為100～300μm。（2）術后6周、12周、24周X線影像學觀察顯示：A組，隨著術后時間延長，新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料植入術后骨痂生成逐漸增多、植入材料與宿主骨之間的界線逐漸模糊，至術后24周，人工材料與自體新生骨融為一體；B組，在術后6周顯示移植骨的吸收與塑形，至術后24周移植骨與自體骨完全融合，無明顯界限。（3）組織形態(tài)學顯示：支架材料孔隙內骨量隨著術后時間延長逐步增加，部分材料降解、被新生骨替代。（4）生物力學測試：術后24周極限抗壓試驗，兩組比較無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結論新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料可誘導骨組織長入孔隙內部、促進松質骨缺損愈合，有望在未來的研究中，廣泛應用于松質骨缺損的治療。

羥基磷灰石；二氧化鋯；骨組織工程；人工椎體

多孔支架材料的應用始于上個世紀70年代，最初主要用于高溫熔融、合金過濾等，后來逐漸擴展到環(huán)境、隔熱、汽車制造、及化學和生物等領域［1］。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，1971年，Rhinelander等［2］率先把多孔支架材料植入犬的脛骨，同時比較與金屬材料的效果差異，術后4月顯示：金屬材料被新生骨組織及纖維組織包裹，而多孔支架材料與新生骨、及宿主骨得到嚴密整合。Benum等［3］將多孔支架材料植入羊的脛骨，術后3月發(fā)現(xiàn)：骨組織已長入泡沫材料內部達2～3mm，術后12月可見材料內部4mm內布滿新生骨組織，未發(fā)現(xiàn)材料相關并發(fā)癥。同時，一些學者對多孔支架材料的機械特性、組織相容性等做了相關研究，結果顯示機械特性尚可、組織相容性較好［4-5］。

制備多孔支架材料的基質材料種類較多，其中最為常用的是羥基磷灰石。羥基磷灰石［Ca10（PO4）6（OH）2］是一種生物活性材料，是構成脊椎動物骨組織的主要無機成分。其植入人體后，會被體液部分降解釋放出人體組織所必需的鈣、磷元素，并被人體組織吸收、利用，結合入新的組織，從而使HA植入物和人體骨組織獲得良好的結合［6］。但是，多孔支架材料的機械強度隨著孔隙率的升高和孔徑的增大幾乎呈直線下降［7］。利用泡沫浸漬技術制備的多孔支架材料平均抗壓強度和彈性模量分別為1.04±0.15MPa和0.1 GPa，而松質骨的抗壓強度和彈性模量分別為2～12MPa和0.3 GPa［8］。故單一的HA材料難以滿足人體松質骨替代的要求、更限制其在承重骨區(qū)域的應用［9］。從而，通過加入不同性能材料來提高HA的力學強度、韌性等性能已得到廣泛關注。本文通過梯度復合二氧化鋯（ZrO2）陶瓷材料來提高其機械性能，因為ZrO2具有較高的彎曲強度、斷裂韌性和較低的彈性模量，且具有一定的生物相容性。研究顯示HA/ZrO2復合材料的抗彎曲強度、抗壓強度明顯高于單純HA［10］。此外，HA/ZrO2在體內、外實驗中顯示出完全的生物相容性，在骨組織、肌肉組織界面未出現(xiàn)副作用，細胞毒性試驗和溶血試驗的反應是微弱的、可接受的［11-12］。因此，梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料為骨移植提供良好的替代材料。本文通過比較梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料與自體髂骨移植修復椎體骨缺損的效果，為理想的骨組織工程支架材料的應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料的制備

實驗選用的添加劑為聚乙烯醇（PVA）、羧甲基纖維素（CMC）、硅溶膠、聚丙稀酸銨（PAA-NH4）、辛醇。將ZrO2粉體和添加劑按照預定配比進行完全混合研磨后和一定量的去離子水進行混合，混合過程采用粉球質量比為1：2，以300r/min的高速球磨機球磨3h制取漿料，而后進行掛漿。掛漿時，將有機泡沫內部多余的漿料通過擠壓法壓出，保證其通孔率，隨后將試樣在室溫下放置18～24h自然干燥，然后放至烘箱中，于110℃烘干12h，使其水分質量分數(shù)降到1％以下。晾干和烘干時，采用翻倒工藝，前10min以1次/min速度翻倒，后翻倒間隔延長至2～3min；然后進行第二次研磨漿料掛漿，采用離心掛漿法，1500r/min離心；最后采用同樣的烘干工藝后進行第3次掛漿，3次掛漿后進行晾曬烘干以供燒結。

燒結時，分別以2℃/min的速度從室溫升至100℃、以1℃/min升溫至200℃、以1℃/2min升溫至500℃并保溫1h、以2℃/3min升溫至750℃并保溫1h、以2℃/min升溫至1200℃，最后以3℃/min升溫至1550℃并保溫燒結3h，然后隨爐冷卻，獲得純ZrO2人工椎體。采取兩步浸涂法涂覆梯度HA涂層，按照原料質量百分比：HA粉末44.5％，磷酸乙酯約1.4％，乙基纖維素約0.18％，蒸餾水53.92％。先將HA在800℃進行預處理，然后將上述其他原料在熱水中進行混合并攪拌5h。將燒結出的多孔陶瓷浸入漿料中，待完全浸透后取出，甩掉多余漿料，100℃下烘干干5h，然后升溫至900℃并燒結5h，最后加熱至1250℃燒結1h；同法進行第二次浸涂漿料。最后根據(jù)實驗需要制得不同規(guī)格的新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料。

1.1.2 實驗動物及分組

普通級比格犬18只，體重10～13kg，月齡5～8月，雌雄不限，均購于浙江中醫(yī)藥大學實驗研究中心【SCXK（浙）2010-0043】。無菌手術在浙江中醫(yī)藥大學實驗研究中心手術室實施【SYXK（浙）2013-0184】。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。將比格犬隨機分成實驗組（A組，植入新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料，12只）和空白對照組（B組，植入自體髂骨，6只）。

1.2 方法

1.2.1 手術方法

手術采用3％的戊巴比妥鈉按1mL/kg的劑量經(jīng)靜脈給藥麻醉，行氣管插管，手術過程持續(xù)呼吸機輔助通氣。取右斜側臥位（軀干與手術臺面成45°角），手術取腰椎前外側（經(jīng)腹膜后）入路，局部脫毛、消毒，沿第12肋后半部下方向下至臍及恥骨聯(lián)合中點平面的腹直肌外緣作腹側方斜切口、長約8～10cm，鈍性分離皮下脂肪顯露腹外斜肌腱膜、沿纖維走向將其分開，切開腹內斜肌，輕輕游離腹膜后腔及其內容物并將其推向內側，顯露手術椎體。充分游離腰3（L3）椎體水平腰橫動脈及伴行靜脈并予以結扎，用鹽水紗布保護并牽開腹主動脈、下腔靜脈及腹腔臟器，充分暴露L3椎體及上下相鄰椎體。在冠狀面以橫突為界鑿除前方2/3椎體，手術復制椎體部分缺損模型，刮除手術節(jié)段相鄰椎間盤。A組實驗動物植入新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料；B組實驗動物植入自體髂骨。確認植入物位置滿意后，再以長度56mm掌骨接骨鋼板固定。逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚。術后單籠常規(guī)飼養(yǎng)；術后3日內每只動物予以青霉素160萬單位肌注，每日一次，以預防感染，術后2周拆線。所有手術操作由同一組醫(yī)生完成。

1.3 觀察指標

1.3.1 新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料結構觀察

觀察材料的一般情況，包括新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料的孔隙率、孔隙分布情況、孔徑的大小，及材料的力學性能。

1.3.2 動物一般情況觀察

觀察實驗動物的四肢活動、飲食、二便情況；手術部位有無紅腫、滲液、感染，及手術切口的愈合情況。

1.3.3 術后影像學觀察

術后6周、12周、24周，在靜脈麻醉下，行腰椎攝片（曝光條件是：44KV，100MA，0.6MS），觀察植入物位置及手術節(jié)段骨痂生長情況。

1.3.4 術后取材及組織切片、染色

分別于術后6周、12周、24周，A組各取2只實驗動物在3％的戊巴比妥鈉（1mL/kg）靜脈麻醉下，利用空氣栓塞法處死動物。暴露手術節(jié)段，相鄰椎體從椎間盤處離斷，取手術節(jié)段比格犬腰椎椎體，剔除椎體周圍的軟組織，鋸除后緣的椎板。用丙酮脫水脫脂7d，甲基丙烯酸甲酯包埋，隔水式恒溫培養(yǎng)箱中保存7d。用硬組織切片機（型號：EXAKT 310 CP）切片，切片厚度約50μm，分別進行蘇木精-伊紅及甲苯胺藍染色，光學顯微鏡下觀察。

1.3.5 生物力學測試（極限抗壓實驗）

將其余實驗動物飼養(yǎng)至術后24周，通過上述方法取得新鮮標本，剔除腰椎椎體周圍的軟組織，保留椎體關節(jié)突關節(jié)完整。將標本置于力學測試系統(tǒng)（型號：Flex Test 40，Load Cell，Hydraulic Power Unit）上并固定，使椎體的長軸平行于壓力軸，壓縮強度速率設定為0.5mm/min，載荷從零開始直到標本破壞為止，試驗機同步記錄載荷-位移曲線，根據(jù)載荷-位移曲線讀取最大抗壓載荷Fm。極限抗壓強度計算公式：P=Fm/S，其中S為受力表面積。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±ss）表示。分別對兩組術后生物力學測試進行比較，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料的結構觀察

采用泡沫海綿體浸漬成型法、聯(lián)合梯度復合及高溫燒結法制備的新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料的孔隙率為25ppi（每英寸25個孔）、孔隙均勻，孔徑為100～300μm；空白材料的極限抗壓強度詳見生物力學的測試結果；根據(jù)實驗需要，制備成不同規(guī)格。肉眼觀察材料呈多孔交聯(lián)狀；顯微鏡下觀察孔徑大小、密度相當，偶見堵孔；掃描電鏡下觀察涂層均勻、梯度復合良好，兩種材料結合致密（彩插6圖1）。

2.2 一般情況觀察

所有實驗動物于術后0.5～2h蘇醒，能站立行走、自主進食，四肢活動情況良好，二便無異常；對外界刺激反應靈敏；術后2周拆線，切口Ⅰ/甲愈合。

2.3 影像學觀察

腰椎攝片，手術骨缺損造模滿意。材料組（A組）：支架材料隨著術后時間延長密度降低，至術后24周，材料密度與自體骨接近，缺損邊界和內部結構模糊，內有毛玻璃樣新骨生成（封3圖2）；自體髂骨組（B組）：術后6周可見骨吸收、植入骨塑形，至24周移植骨與自體骨完全融合（封3圖3）。

2.4 組織學觀察結果

蘇木精-伊紅染色和甲苯胺藍染色顯示，隨著術后時間延長，均可見新生骨小梁向材料孔隙內爬行、并逐漸增加，材料與宿主骨界面模糊，術后24周可見部分材料降解被新生骨小梁替代、剩余材料被新生骨小梁包裹，二者交聯(lián)，結合緊密（封3圖4～5）。

2.5 生物力學測試結果

術后24周極限抗壓試驗結果顯示：空白新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料的極限抗壓強度為2.52MPa±0.46MPa，A組手術椎體的體外極限抗壓強度為13.98 MPa±1.64MPa；B組為14.72MPa±2.02MPa。兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖6）。

注：術后24周，新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料組（A組）與自體髂骨組（B組）的極限抗壓強度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），兩組的抗壓強度均大于空白HA/ZrO2材料（P＜0.05），（*差異有顯著統(tǒng)計學意義，P＜0.05）。圖6 生物力學測試結果Note：There was no significant difference between the two subgroups（P＞0.05）in the maximum compressive strengths of biomachanics test at 24 weeks of post-operation，which was higher than that of pure HA/ZrO2material（P＜0.05），（* significant difference，P＜0.05）.Fig.6 Biomechanical results

3 討論

目前，常用的人工骨材料多為密質材料，僅能起到骨替代的作用，無法引導新生骨爬行至移植物內并使之融為一體。這也意味著移植材料在體內存在著耗損、老化、斷裂的風險。HA多孔支架材料能誘導新生骨組織長入支架內部，從而達到宿主骨組織與支架材料的嚴密整合，成功解決了當前密質材料的問題［13］。與其他醫(yī)用生物支架材料相比，HA具有良好的生物相容性、骨誘導性及骨傳導性。但是，材料孔徑的大小直接影響新生骨細胞的粘附及新生血管的長入，3-D網(wǎng)狀連接的孔隙為新生骨和血管提供一個通道［14-15］。有學者指出，孔徑大于100μm可以為新生骨細胞、及血管的生長提供一個支架，利于成骨細胞、軟骨細胞及血管內皮細胞在其內部分化、擴增和爬行［16-17］。然而，材料的機械強度隨著孔隙率的升高和孔徑的增大而降低，通過加入不同性能的材料，來解決HA的力學強度、韌性不足等問題。

本研究通過把HA和ZrO2粉末梯度復合制備成多孔支架材料、并將材料植入比格犬椎體骨缺損處，術后24周極限抗壓試驗結果顯示：HA/ZrO2梯度復合多孔材料組體外的極限抗壓強度為13.98MPa±1.64MPa，達到松質骨的抗壓強度（2～12MPa）［8］；自體髂骨組為14.72MPa±2.02MPa。兩組比較無明顯統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。實驗結果顯示本材料即達到多孔支架材料的效果，又具有可靠的機械強度?，F(xiàn)已有實驗表明，HA陶瓷材料中有選擇地加入第二相生物惰性材料（ZrO2）顆?？梢燥@著提高材料的斷裂韌性，由于其具有良好的機械力學性能，基體與HA梯度復合制成多孔支架材料后，增加其生物相容性，用于承載種植體，當支架材料受到外加應力而產生裂紋時，第二相顆料能夠有效地吸收能量，阻止材料斷裂，從而提高材料的機械特性，達到人體承重骨的使用要求［18］。

從組織學觀察結果看，隨著術后時間延長，新生骨小梁向材料孔隙內爬行、并逐漸增加，術后24周可見部分材料降解、并被新生骨小梁取代、剩余材料被新生骨小梁包裹，二者交聯(lián)，結合緊密。但是僅靠骨自身細胞增殖速度較慢，隨著干細胞技術的快速發(fā)展，骨髓間充質干細胞（BMSCs）已被廣泛應用，由于其可通過體外分離、培養(yǎng)、擴增，在不同誘導條件下可向骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞和內皮細胞等方向轉化，且具有取材方便、體外增殖能力強、易于基因操作等優(yōu)勢，逐漸成為基因治療適宜的細胞載體［19-20］。根據(jù)文獻報道，通過體外培養(yǎng)、擴增的BMSCs種植于多孔羥基磷灰石可促進異位成骨、加速新生骨長入多孔結構內部孔道［21-22］。但獲取BMSCs通常需要額外的手術，故受時間、地點及組織來源等限制，術后可能會出現(xiàn)取材局部的感染、愈合不良等并發(fā)癥，且BMSCs會隨著供者年齡的增長而增殖能力下降。

本課題計劃在后續(xù)的研究中，應用誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）來源的MSCs種植于HA/ZrO2梯度復合多孔材料上，將上述材料植入實驗動物骨缺損處，觀察其作用效果，并逐步應用于臨床。iPSCs具有和胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）類似的多潛能、多克隆分化等特性，且可以避免應用ESCs所面臨的免疫排斥和倫理問題［23］。目前，iPSCs可以通過同源宿主體細胞重編程獲得，例如人類纖維母細胞［24］、原始肝細胞［25］、神經(jīng)干細胞［26］，及其他體細胞等［27-29］。但直接應用iPSCs有形成畸胎瘤的潛在風險，有研究證實iPSCs可以在體外誘導分化成MSCs［30］，來源于iPSCs的MSCs與H9-hECs有相似的特性，可通過誘導向成骨細胞和成軟骨細胞等分化［31］。以iPSCs來源的MSCs種植于新型梯度復合HA/ZrO2多孔支架材料，構建的組織工程骨有望成為未來骨組織工程研究和應用的主流。

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In vivo experiments of porous gradient bio-composites with HA/ZrO2in repair of the lumbar vertebra defect

SHAO Rong-xue1，QUAN Ren-fu2，ZHANG Liang2，XIE Shang-ju2，YANG Di-sheng3，WEI Xi-cheng4
（1.Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China；2.Department of Orthopedics，Xiaoshan Traditional Chinese Medical Hospital，Hangzhou 311200，China；3.Department of Orthopedics，the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University，Hangzhou 310000，China；4.College of Materials Science and Engineering，Shanghai University，Shanghai 200072，China）

ObjectiveTo evaluate the effect of porous gradient composites with hydroxyapatite（HA）/zirconia（ZrO2）in repair of lumbar vertebra body defects of dogs.Methods（1）New porous gradient HA/ZrO2bio-composites were prepared using Foam impregnation，gradient compound and high temperature sintering；（2）A total of 18 adult Beagledogs，weighted 10～13 kg and aged 5～8 months，were assigned randomly into two subgroups and were implanted with new porous gradient HA/ZrO2bio-composites（subgroup A in 12）and autologous iliac bone（subgroup B in 6）；（3）The relative data was analyzed on roentgenoscopy，mophology and biomechanics of post-operation.The effect was compared between the subgroup A and the subgroup B to repair the vertebral body defect.ResultsThe porocity of new porous gradient HA/ZrO2bio-composites is 25 ppi（pores per inch），and the pores are well distributed with diameter of 100～300μm.The roentgenoscopy of post-operation displayed that new-bone formation is increased gradually，and the interface between bio-composite and host-bone becomes blur，and the new-bone around the bio-composite integrated into host-bone at 24 weeks of post-operation in subgroup A.As to subgroup B，the resorption and restructure were found at 6 weeks after the surgery，and the graft-bone and host-bone have integrated completely without obvious boundary at 24 weeks of postoperation.Histomorphology study showed that the amount of bone within pores of the scaffold material increased with a prolonged postoperative，and that partial bio-composite was degradated and replaced by new host-bone.There was no significant difference between the two subgroups（P＞0.05）in the maximum compressive strengths of biomachanics test.ConclusionsNew porous gradient HA/ZrO2bio-composites can induce bone tissue to grow into the pores，and promote the repair of cancellous bone defect，which may be applied widely to the treatment of cancellous bone defect in the future.

Hydroxyapatites；Zirconia；Bone tissue engineering；Artificial vertebrae

R-332

A

1671-7856（2015）11-0046-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2015.11.011

浙江省科技廳計劃項目（2012C33114）。

邵榮學（1980-），男，博士生，研究方向：骨組織工程材料、脊柱關節(jié)疾病的診治。Email：shaorongxue@163.com。

全仁夫（1969-），男，博士生導師，教授。Email：spinequan@yahoo.com。

﹞2015-10-13