呂建敏

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053）

OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨骼發(fā)育營(yíng)養(yǎng)需要評(píng)估中的應(yīng)用

呂建敏

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州 310053）

OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)是調(diào)節(jié)骨代謝的主要信號(hào)通路，在維持骨形成和吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用。本文主要綜述OPG/RANK/RANKL的特點(diǎn)、作用機(jī)制，及其在骨代謝疾病、藥物和相關(guān)營(yíng)養(yǎng)因素干預(yù)效果評(píng)價(jià)等領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀，并展望將其引入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨骼發(fā)育營(yíng)養(yǎng)評(píng)估領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

OPG；RANK；RANKL；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；骨骼發(fā)育；營(yíng)養(yǎng)需要

骨骼發(fā)育需要多種營(yíng)養(yǎng)成分參與，這些營(yíng)養(yǎng)成分（如鈣、磷等）不僅是骨骼的重要組成成分，而且對(duì)維持正常骨代謝具有重要意義［1］。骨形成和吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡是保持正常骨代謝必要條件，而這種平衡需要依靠相應(yīng)的細(xì)胞通路來調(diào)節(jié)。OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)是近年發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)骨代謝的重要通路［2-3］，由腫瘤壞死因子家族的三個(gè)新成員―①護(hù)骨素（osteoprotegerin，OPG）、②核因子κB受體活化子（receptor activator of NF-κB，RANK）和③核因子κB受體活化子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）組成。目前，有關(guān)OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)在骨代謝疾病病因?qū)W及藥物療效評(píng)價(jià)研究等領(lǐng)域報(bào)道很多，而在營(yíng)養(yǎng)干預(yù)效果評(píng)價(jià)方面則報(bào)道較少。因此，本文在闡述OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)的特點(diǎn)和作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，對(duì)近年來該系統(tǒng)在骨代謝疾病及相關(guān)藥物和營(yíng)養(yǎng)因素療效評(píng)價(jià)的研究進(jìn)展作一綜述，為將其廣泛應(yīng)用于與骨代謝相關(guān)的營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)概述

1.1 OPG，RANK和RANKL的結(jié)構(gòu)與功能

1.1.1 骨保護(hù)素（OPG）

OPG是由Simonet等［4］于1997年首先在大鼠上發(fā)現(xiàn)的一種新型腫瘤壞死因子，屬于TNF受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族成員。大鼠、人、和小鼠OPG同源性大于85％［4］。OPG mRNA可在小鼠皮膚、肝臟、肺和心臟等組織中表達(dá)［4］。OPG蛋白屬分泌型糖蛋白，無疏水跨膜區(qū)，氨基酸全長(zhǎng)為401個(gè)殘基，包含21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和380個(gè)氨基酸成熟肽［5］，共7個(gè)結(jié)構(gòu)域（D1～D7）：D1～D4區(qū)為半胱氨酸含量豐富區(qū)域，位于N端，主要功能是抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收；D5、D6區(qū)是位于C端的高度同源的兩個(gè)區(qū)域，為死亡域。D7區(qū)含有肝素結(jié)合位點(diǎn)，可通過N端糖基化，形成巰基化二聚體［4］。

OPG主要功能是作為誘餌受體調(diào)節(jié)配體和受體之間的相互作用。如OPG與RANKL具有高度結(jié)合能力，是RANKL的誘餌樣受體，對(duì)RANK信號(hào)起著負(fù)調(diào)控的作用。體外實(shí)驗(yàn)表明OPG可抑制破骨細(xì)胞（osteoclast，OC）產(chǎn)生［4］。

1.1.2 NF-κB受體活化因子（RANK）

RANK也屬于TNF受體家族成員，是RANKL的信號(hào)受體，屬I型跨膜蛋白。人的RANK蛋白是由616個(gè)氨基酸的組成的同源三聚體，其胞外結(jié)構(gòu)由208個(gè)氨基酸組成，包含4個(gè)富含半胱氨酸的重復(fù)序列［6］，為N-末端，主要功能是與RANKL的C-端結(jié)合并產(chǎn)生傳遞信號(hào)。RANK在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞需要由細(xì)胞漿內(nèi)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAFs）介導(dǎo)［7］。RANK蛋白的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域有383個(gè)氨基酸，在細(xì)胞膜末端的氨基酸胞質(zhì)尾區(qū)可與TRAF家族中的1、2、3、5因子結(jié)合，使其活性被激活；在細(xì)胞膜近端Pro-X-Glu-X-X-（aromatic/acid residue）結(jié)合部與TRAF6結(jié)合［8］。RANK mRNA廣泛存在于胸腺、肝臟、骨胳肌、結(jié)腸、胰腺、腎上腺、心臟、乳腺、骨髓、肺、腦、腎臟、皮膚等組織器官［9］。

RANK信號(hào)區(qū)別于其他TNFR超家族成員的一個(gè)重要特征是它不僅可激活典型的NF-κB信號(hào)通路，還可以激活非典型的NF-κB信號(hào)通路［10］。RANK的主要功能是與RANKL結(jié)合形成RANKRANKL信號(hào)，在相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的參與下，促進(jìn)OC的形成和骨吸收功能的加強(qiáng)［11］。

1.1.3 RANK的配體（RANKL）

RANKL是由4個(gè)獨(dú)立的研究團(tuán)隊(duì)分別發(fā)現(xiàn)并加以命名的腫瘤壞死因子超家族成員［12］，因此還被稱為腫瘤壞死因子活化誘導(dǎo)細(xì)胞因子（TRANCE），破骨細(xì)胞分化因子（ODF），護(hù)骨素配體（OPGL）。

RANKL蛋白屬II型跨膜蛋白，與腫瘤壞死因子超家族（TNFSF）成員中的TRAIL，F(xiàn)asL和TNF-a具有同源性［13］。人和小鼠的RANKL蛋白具有83％的同源性［11］，小鼠的RANKL蛋白包含316個(gè)氨基酸，由細(xì)胞外C-端受體作用區(qū)域和跨膜區(qū)域組成。研究發(fā)現(xiàn)RANKL蛋白存在膜結(jié)合和分泌型兩種形式［9］。RANKL蛋白有3種不同的亞型，最短的亞型缺乏細(xì)胞內(nèi)區(qū)域和跨膜區(qū)，以分泌型存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，對(duì)RANKL活性具有抑制作用［14］。

RANKL mRNA可在多種組織表達(dá)，包括T淋巴細(xì)胞，成骨細(xì)胞，骨細(xì)胞，骨基質(zhì)和肺［12］。RANKL不僅可與功能性受體―RANK結(jié)合，還可以與誘餌受體―OPG結(jié)合［12］。RANKL對(duì)骨代謝具有重要調(diào)節(jié)作用，它與RANK結(jié)合后產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄活化信號(hào)，可促進(jìn)OC的分化成熟［13］。

1.2 OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制

OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)在維持骨吸收和骨形成兩者動(dòng)態(tài)平衡，防止骨的丟失，保證正常的骨轉(zhuǎn)化更新等方面起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用［15］，并主導(dǎo)了破骨細(xì)胞（OC）的形成和活化的調(diào)控［16］。其作用機(jī)制是［16］：破骨細(xì)胞（OC）和成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）分別介導(dǎo)骨的吸收和合成過程，RANKL主要由成骨細(xì)胞前體細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，RANK主要由破骨細(xì)胞表達(dá)，RANKL與RANK結(jié)合，可促進(jìn)破骨細(xì)胞分化、融合及成熟，并抑制破骨細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)骨的吸收；與此同時(shí)，成骨細(xì)胞也表達(dá)OPG，OPG實(shí)質(zhì)上是一種受體誘餌，可與RANKL家族競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的形成、成熟。RANK與OPG競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL的結(jié)合，使骨吸收和骨形成處于平衡狀態(tài)（圖1）。因此，正常情況下，骨組織中RANKL、RANK與OPG三者相互間比值保持恒定，一旦由于某種原因使這種穩(wěn)態(tài)被打破，就可能引起骨代謝紊亂，導(dǎo)致相應(yīng)骨代謝疾病的發(fā)生。如OPG缺失小鼠具有骨質(zhì)疏松的骨病變［17］，其病因就是OPG缺失使體內(nèi)OPG、RANK、RANKL相互間的正常比例被打破，RANKL與RANK結(jié)合的能力增強(qiáng)，從而促進(jìn)了OC的增殖。

圖1 OPG/RANK/RANKL對(duì)骨代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制［16］Fig.1 Regulatory mechanisms of bone remodeling：role of RANK，RANKL，and OPG in osteoclast activation

2 OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)在骨代謝疾病和藥物療效研究中應(yīng)用現(xiàn)狀

在骨代謝疾病研究方面，大量資料顯示，許多先天遺傳性骨?。?8-19］（和后天獲得性骨代謝疾?。?0-21］都與OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)發(fā)生異常密切相關(guān)。遺傳性骨病變的產(chǎn)生的主要原因就是OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)中的相關(guān)基因編碼發(fā)生了改變，如家族擴(kuò)張性骨質(zhì)溶解癥（FEO）的發(fā)病與RANK基因編碼外顯子1瞬間框內(nèi)復(fù)制有關(guān)［18］；少年P(guān)aget’s病的骨病變主要由OPG基因編碼發(fā)生突變所致［19］。OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)在骨質(zhì)疏松和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等后天獲得性骨代謝疾病的發(fā)病過程中也起著重要作用。目前已證實(shí)，絕經(jīng)期后婦女骨質(zhì)疏松的發(fā)病原因是由于絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平急劇下降，引起骨髓細(xì)胞RANKL水平的上升，RANKL/OPG的比值發(fā)生改變，增強(qiáng)了OC的骨吸收功能［20］；有關(guān)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）大鼠模型的研究也證明在RA形成過程中存在RANK/RANKL/OPG表達(dá)異常［21］，該研究顯示，RA模型動(dòng)物的關(guān)節(jié)滑液中CD3+T細(xì)胞的RANK、RANKL表達(dá)明顯升高，并伴有OPG表達(dá)減少。

另一方面，與骨代謝疾病相關(guān)的藥效學(xué)研究顯示，一些與此相關(guān)的激素（如甲狀旁腺激素（PTH）、糖皮質(zhì)激素、雌激素）和藥物都可調(diào)節(jié)OPG、RANKL、RANK的表達(dá)。如甲狀旁腺激素（PTH）可使RANKL表達(dá)持續(xù)升高，而對(duì)OPG產(chǎn)生起到抑制作用，導(dǎo)致骨吸收作用增強(qiáng)［22］；王建忠等［23］研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可使OPG mRNA表達(dá)降低，RANKL mRNA表達(dá)增高，使RANKL/OPG比值上升，從而加速破骨細(xì)胞的分化。Shu等［24］觀察了一種植物異黃酮類藥物―鷹嘴豆芽素A（BCA）對(duì)卵巢切除大鼠骨丟失的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)BCA可降低大鼠股骨組織RANKL/OPG mRNA比值，起到防止骨破壞作用；馮建書等［25］在研究仙靈骨葆的療效時(shí)也證實(shí)該藥物對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠的治療作用是通過促進(jìn)OPG的表達(dá)，抑制RANK及RANKL的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。以上一系列研究表明PG/RANK/RANKL系統(tǒng)可較直觀反映骨代謝疾病的發(fā)病原因和藥物的干預(yù)效果，是研究骨代謝特征的重要標(biāo)志物。

3 OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)在骨骼發(fā)育營(yíng)養(yǎng)需要研究中的應(yīng)用前景

3.1 傳統(tǒng)骨骼發(fā)育營(yíng)養(yǎng)需要研究方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的局限性

在骨骼發(fā)育營(yíng)養(yǎng)需要（如鈣、磷等需要量的研究）研究的方法學(xué)上，傳統(tǒng)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)通常是通過“劑量―反應(yīng)”、“析因法”及“平衡試驗(yàn)”等方法來研究和確定動(dòng)物鈣、磷需要量的推薦值，主要采用的觀察指標(biāo)是動(dòng)物的生長(zhǎng)性能，平衡狀況指標(biāo)、骨骼和血液指標(biāo)［26］。以上方法雖然操作簡(jiǎn)單，但存在工作量大，準(zhǔn)確度低，不能精確反映鈣、磷等相關(guān)營(yíng)養(yǎng)攝入對(duì)骨代謝的影響等缺點(diǎn)。同時(shí)，與經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的生產(chǎn)目的不同，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)目的是為科學(xué)研究提供健康、標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)材料。在研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鈣、磷需要量時(shí)，不僅要考慮宏觀水平上的標(biāo)準(zhǔn)化，更需要關(guān)注一些微觀的、更能精準(zhǔn)反映骨代謝情況的生理指標(biāo)。

3.2 OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)在骨骼營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)為營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究提供了新的方法，營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究的相關(guān)參數(shù)也從宏觀向微觀發(fā)展。一些調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因和蛋白逐步受到人們的重視。如在鈣、磷等營(yíng)養(yǎng)成分與骨代謝關(guān)系的研究過程中，人們發(fā)現(xiàn)鈣、磷攝入水平的變化會(huì)引起體內(nèi)一些激素和細(xì)胞因子水平的改變（如甲狀旁腺激素（PTH）、降鈣素（CT）、1α，25-雙羥維生素D3等），它們作用于成骨細(xì)胞和/或破骨細(xì)胞，進(jìn)而影響骨代謝并使骨組織形態(tài)發(fā)生改變［27］。而以上因素對(duì)骨代謝的作用最終都是通過直接或間接調(diào)節(jié)OPG、RANK和RANKL的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的［28］。因此，OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)是反映骨代謝水平的核心環(huán)節(jié)。

目前，有關(guān)營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)影響的研究報(bào)道較少，但僅有的幾個(gè)報(bào)道都充分證明該系統(tǒng)可作為反映骨代謝水平的重要指針，用于營(yíng)養(yǎng)干預(yù)對(duì)骨代謝影響的系統(tǒng)性研究。如Shin-ichi等［29］研究高磷日糧對(duì)大鼠骨代謝的影響，發(fā)現(xiàn)高磷日糧可顯著提高大鼠股骨中RANKL mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)量增加和骨量的大量丟失。Dan Liang M等［30］利用體外細(xì)胞培養(yǎng)方法，觀察了微量元素鋅對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)適量的鋅可使細(xì)胞內(nèi)OPG基因和蛋白的表達(dá)顯著提高，并推斷鋅可能是通過改變成骨細(xì)胞中的OPG表達(dá)水平來影響骨的重塑，且鋅與骨骼形成和吸收的動(dòng)態(tài)平衡間存在一定劑量關(guān)系。Spyridon Kanellakis等（2012）［31］在研究富含鈣、磷、VD和VK的營(yíng)養(yǎng)日糧對(duì)絕經(jīng)婦女骨代謝影響時(shí)，首次以血清OPG、RANKL的水平為主要參數(shù)來評(píng)估營(yíng)養(yǎng)干預(yù)對(duì)骨代謝的作用效果，為骨骼營(yíng)養(yǎng)學(xué)的研究提供了新的途徑。據(jù)此，我們可以將OPG/RANK/RANKL作為骨骼發(fā)育營(yíng)養(yǎng)需要研究的一種新手段，通過定量研究某種營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)OPG/RANK/RANKL表達(dá)的影響，探詢營(yíng)養(yǎng)因素與RANK/RANKL/OPG表達(dá)之間的相關(guān)性，最終較精確地評(píng)估動(dòng)物對(duì)該種營(yíng)養(yǎng)成分的需要量。

4 總結(jié)

OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)是近年來骨科學(xué)研究的重大發(fā)現(xiàn)，不僅為骨代謝疾病發(fā)病機(jī)制和治療手段的研究開辟了新方向，也為骨骼營(yíng)養(yǎng)方法學(xué)研究提供了一種全新思路。OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)在骨骼營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究中應(yīng)用的不斷完善，必將為營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究帶來廣闊的前景。

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Prospect of OPG/RANK/RANKL system in assessing nutrient requirement for bone development in laboratory animal

LV Jian-min
（Laboratory Animal Research Center，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

OPG/RANK/RANKL system is an important signaling pathway in regulating bone metabolism，which plays key role in maintaining bone homeostasis.This paper focus on characteristic and regulation mechanism of OPG/RANK/RANKL system，and its current utility in the areas of bone metabolism diseases，pharmacodynamic and nutrient facts assessment.Furthermore，the prospect of OPG/RANK/RANK system in assessing nutrient requirement for bone development in laboratory animal was elaborated.

OPG；RANK；RANKL；Laboratory animal；Bone development；Nutrient requirement

R-332

A

1671-7856（2015）11-0076-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2015.11.016

浙江省科技廳資助項(xiàng)目基金（2014C37008）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金（XTD201301）。

呂建敏（1971-），女，研究員，博士，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)。E-mail：ljm6666@163.com。

﹞2015-10-15