魏清清　李姜維　楊金燕等

摘要：試驗(yàn)從四川省攀枝花市朱家包包釩鈦磁鐵礦區(qū)的表層土壤中篩選出21株釩抗性微生物，經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序鑒定可知，篩選所得的微生物分別屬于放線菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱。這些菌株的獲得將為釩污染地區(qū)微生物資源的開發(fā)利用及礦區(qū)生態(tài)修復(fù)提供理論和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：釩；抗性微生物；篩選

中圖分類號(hào)：X53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）05-1073-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.011

Abstract： 21 strains of microorganisms with vanadium-resistance were screened from the surface soil at ZhuJiaBaoBao V-Ti-bearing magnetite， Panzhihua. The results of sequencing 16S rRNA gene showed that these bacterial strains were belonged to Actinobacteridae， α-proteobacteria， β-proteobacteria and γ-proteobacteria， respectively. It will provide a theoretical and experimental supports for future exploitation of microbial resource in vanadium-polluted area and bioremediation of the vanadium mine area.

Key words： vanadium； metal-resistant microorganism； screening

釩鈦磁鐵礦是含有鐵、釩、鈦、鉻等多種重金屬的共生礦，有很高的綜合利用價(jià)值。中國(guó)67.56%的釩資源來自釩鈦磁鐵礦[1]。釩的冶煉和釩合金的冶煉是環(huán)境中釩污染的重要來源。釩作為人體必需的微量元素具有多方面的生理作用，然而釩同時(shí)具有多方面的毒性和危害性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道金屬釩毒性很低，但釩化合物對(duì)人及動(dòng)物有中度或高度毒性[2]。其毒性作用與釩的價(jià)態(tài)、溶解度、攝取的途徑等有關(guān)，價(jià)態(tài)越高，毒性越大[3]。除明顯的急性中毒外，釩對(duì)人體尚有生殖毒性、胚胎毒性，可能還有致突變、致畸、致癌等毒性[4，5]。

基于微生物對(duì)重金屬的積累和解毒作用，近年來以凈化有毒金屬污染為目的的生物修復(fù)技術(shù)正在興起。微生物修復(fù)技術(shù)因其處理費(fèi)用低、效率高、對(duì)環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到廣泛的關(guān)注[6-9]。

在過去的幾十年里，國(guó)內(nèi)外一些研究機(jī)構(gòu)已在釩的生物效應(yīng)及其環(huán)境地球化學(xué)行為等方面開展了大量研究工作，取得了一系列的成果[10-12]。這些研究成果是確定釩的環(huán)境行為，客觀評(píng)價(jià)釩的生物可利用性和毒理性不可缺少的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為人們有效地控制釩污染提供了科學(xué)依據(jù)。但有關(guān)釩污染生物修復(fù)方面的報(bào)道并不多見。

四川省攀枝花市朱家包包釩鈦磁鐵礦區(qū)位于攀枝花蘭家火山礦區(qū)東部，在該礦開采期間，產(chǎn)生大量粉塵、廢水和廢渣，這些廢棄物中含有大量的釩，通過揚(yáng)塵、雨水沖刷等途徑擴(kuò)散到周圍環(huán)境中，致使與該礦毗鄰的水資源、農(nóng)田土壤受到嚴(yán)重的重金屬污染。為此，希望通過篩選一批重金屬釩的抗性細(xì)菌，為礦區(qū)釩污染的生態(tài)修復(fù)提供菌種儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

試驗(yàn)土樣采自四川省攀枝花朱家包包釩鈦磁鐵礦區(qū)，采集表層（0～20 cm）土壤。土壤pH 8.03，土壤有機(jī)質(zhì)含量為2.52±0.04 g/kg。土壤中V、Cr、Pb、Ni、Zn全量采用HF-HNO3-HClO4消煮，原子吸收法 （PerkinElmer AAS800，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)定[13]（表1）。

1.1.2 土樣的預(yù)處理 土樣置于無菌條件下的超凈工作臺(tái)中，經(jīng)過濾后的空氣風(fēng)干，過篩。用于篩菌的土樣過10目篩后裝于采樣瓶中，4 ℃下保存?zhèn)溆?。采樣瓶和篩子需用紫外進(jìn)行滅菌預(yù)處理。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑 無機(jī)鹽液態(tài)培養(yǎng)基（1 L）：硫酸鈉 2 g，磷酸氫二鉀 6 g，磷酸二氫鉀 5.5 g，氯化鉀 2 g，七水合硫酸鎂 0.2 g，微量元素 1 mL。

無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基：硫酸鈉 2 g，磷酸氫二鉀 6 g，磷酸二氫鉀 5.5 g，氯化鉀 2 g，七水合硫酸鎂 0.2 g，微量元素 1 mL，瓊脂 2.5 g，蒸餾水 200 mL。

有機(jī)培養(yǎng)基：蛋白胨 2 g，牛肉膏 1 g，氯化鈉 2 g，瓊脂 2.5 g，蒸餾水 200 mL。

微量元素配方（1 L）：二水合乙二胺四乙酸二鈉 55.0 g，七水合硫酸鋅 3.93 g， 氯化鈣 5.5 g，一水合硫酸錳 4.32 g，七水合硫酸亞鐵 5.0 g，四水合鉬酸銨 1.1 g，五水合硫酸銅 1.57 g，六水合氯化鈷 1.61 g， pH 7.0。

重金屬釩的加入，分別用濃度為1 000 mg/L的硫酸氧釩和偏釩酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋得到所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離純化 分別稱取1 g土樣加入到100 mL的含重金屬釩濃度分別為10、30、60、100、200 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，對(duì)抗性菌種進(jìn)行馴化。于28 ℃條件下，將混有土樣的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基置于搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min。培養(yǎng)14 d后，吸取5～10 mL原培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)恒溫?fù)u床培養(yǎng)14 d。

連續(xù)轉(zhuǎn)接馴化4～5次，對(duì)馴化后的菌液進(jìn)行稀釋涂布，取10-3和10-4的稀釋液各100 μL分別于含4價(jià)和5價(jià)重金屬濃度為10、30、60、100、200 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)平板上涂布培養(yǎng)，不同濃度梯度各做一組平行。

采用同樣的方法將菌液涂布于有機(jī)培養(yǎng)平板上進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)一段時(shí)間后，根據(jù)出現(xiàn)菌落的形態(tài)特征做好標(biāo)記，用接種環(huán)挑取單菌落，以劃線法接種到新的培養(yǎng)平板中[14]，用封口膜封口，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重復(fù)上述操作，直至獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 DNA的提取 試驗(yàn)采用加入蛋白酶K的方法使細(xì)菌細(xì)胞裂解。核酸抽提使用的是TIANGEN公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）。按照說明書上的使用步驟進(jìn)行操作。得到的DNA于4 ℃條件下保存。

1.2.3 釩抗性細(xì)菌的16s rRNA基因序列分析 對(duì)供試菌體進(jìn)行16s rRNA基因PCR擴(kuò)增[15]。正向引物27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R序列為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。 PCR反應(yīng)體系（25 μL）：細(xì)菌基因組DNA模板 1 μL，引物27F 0.5 μL，引物1492R 0.5 μL，ExTaq聚合酶體系12.5 μL，去離子水 10.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，29個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。將PCR產(chǎn)物送于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

將測(cè)序公司反饋回來的測(cè)序結(jié)果，運(yùn)用DNAMAN軟件將兩端引物以外的序列去除，余下的序列提交到模式菌種庫進(jìn)行比對(duì)。將菌株序列及其相似度最高的模式菌種序列用DNAMAN軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行16S rRNA基因同源性分析，發(fā)育樹的構(gòu)型和穩(wěn)定性用DNAMAN軟件取樣分析1 000次，進(jìn)行Bootstrap值分析和評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

從有機(jī)培養(yǎng)基中篩選出11株菌，其中9株屬于變形菌門，2株屬于放線菌門。其中，4價(jià)釩培養(yǎng)基中篩選到的菌株全部為變形菌門，而2株屬于放線菌門的細(xì)菌均從5價(jià)釩培養(yǎng)基篩選得到（表2）。有機(jī)培養(yǎng)基中篩選出的優(yōu)勢(shì)菌大部分為伯克氏菌屬。從無機(jī)培養(yǎng)基中篩選出10株菌，其中5株屬于變形菌門，5株屬于放線菌門，4價(jià)釩和5價(jià)釩培養(yǎng)基中篩選到的兩類菌各占一半。而其中的IV4_2、IV5_4和IV5_5與模式菌的相似度達(dá)100%。所有這21株釩抗性細(xì)菌中，7株屬于放線菌門，占全部菌株的33%；14株屬于變形菌門，占全部菌株的67%，屬于優(yōu)勢(shì)菌群。菌種的門類結(jié)構(gòu)見圖1。

鄭曉丹等[16]從16株抗汞細(xì)菌中篩選得到1株有較強(qiáng)抗重金屬鎘能力的細(xì)菌，屬于γ-變形菌綱氣單孢菌目。盛下放等[17]從不同來源的土壤樣品中篩選得到的2株鎘抗性細(xì)菌分屬于γ-變形菌綱假單孢菌目和芽孢桿菌綱芽孢桿菌目。耿印印等[18]從鎘含量超標(biāo)的土壤中分離得到的14株鎘抗性細(xì)菌中，變形菌占總數(shù)的85.7%，屬于優(yōu)勢(shì)菌群。卞光凱等[19]從江蘇南通沿海灘涂耐鹽植物的內(nèi)生細(xì)菌中篩選得到的23株重金屬抗性細(xì)菌分別屬于變形菌門和厚壁菌門。由此可見，重金屬抗性微生物在群落結(jié)構(gòu)上有其相似的地方，可以作為后續(xù)研究的重點(diǎn)方向。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，釩抗性菌可分為4個(gè)類群：放線菌綱、α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱。其中，IV4_2、IV5_4和IV5_5的親緣關(guān)系較近，均與模式菌Pimelobacter simplex（KCTC 9106）處在同一分支下，都屬于放線菌綱。而IV4_3、IV5_3、OV5_6和OV5_7也屬于放線菌綱。IV5_1和IV5_2的親緣關(guān)系較近，均與模式菌Methylopila capsulate IM1處在同一分支下，都屬于α-變形菌綱。而IV4_1、IV4_4和IV5_6也屬于α-變形菌綱。OV4_2、OV4_3、OV4_4、OV5_2、OV5_3、OV5_4和V5_5的親緣關(guān)系較近，均與模式菌Burkholderia fungorum （LMG 16225）處在同一分支下，都屬于β-變形菌綱。而OV4_1和OV5_1的親緣關(guān)系較近，均與模式菌Pseudomonas otitidis （MCC10330）處在同一分支下，都屬于γ-變形菌綱（圖2）。

3 小結(jié)與討論

微生物作為人類最寶貴、最具開發(fā)潛力的資源寶庫，種類繁多、分布廣泛，具有繁殖迅速、個(gè)體微小、比表面積大、對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)。在受重金屬污染的生態(tài)環(huán)境中，微生物產(chǎn)生各種變化以適應(yīng)重金屬的脅迫。篩選耐重金屬細(xì)菌的一般途徑是在培養(yǎng)基中加入特定的金屬，再逐步提高該重金屬濃度的馴化條件下，經(jīng)多代傳種而獲得目的菌株。

本研究從攀枝花市朱家包包釩鈦磁鐵礦區(qū)邊坡的土壤樣品中篩選到21株細(xì)菌。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，從含低濃度重金屬釩的培養(yǎng)基平板中篩選出來的細(xì)菌都可以在200 mg/L釩離子濃度條件下生長(zhǎng)，表明這21株細(xì)菌均可以耐受較高濃度的重金屬釩。

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