李 禮，樊小農(nóng)，付靜靜，沈 燕，王 舒△

(1.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 300193;2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸研究所，天津 300193; 3.青島市海慈醫(yī)療集團，山東青島 266000)

差異蛋白質組學在中醫(yī)藥領域研究路線及應用現(xiàn)狀?

李 禮1，樊小農(nóng)2，付靜靜3，沈 燕2，王 舒2△

(1.天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 300193;2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸研究所，天津 300193; 3.青島市海慈醫(yī)療集團，山東青島 266000)

差異蛋白質組學從整體角度分析在不同狀態(tài)下體內(nèi)蛋白質表達的動態(tài)演變過程，其研究方法與傳統(tǒng)中醫(yī)強調(diào)整體觀的思想相符合。故創(chuàng)新性地剖析差異蛋白質組學應用于中醫(yī)證候學、中藥學和針灸學領域的研究路線，如證候實質研究、同病異證、異病同證、同類證等證候學研究，藥材炮制及道地性、中藥作用機制靶點及方證相關等中藥學相關研究，以及經(jīng)穴特異性、針刺量效關系、臟腑相關及針灸療效作用機制等針灸學領域研究。同時，歸納分析差異蛋白質組學在相關領域的應用現(xiàn)狀及局限性。

差異蛋白質組學;研究路線;中醫(yī)證候學;中藥學;針灸學

差異蛋白質組學是一種通過與正常生理狀態(tài)下蛋白質的表達進行比較分析，明確疾病病理變化過程或治療干預作用機制的方法［1］，可避免短期內(nèi)不能實現(xiàn)獲得有關生命活動的“全景式信息”的弊端［2］。差異蛋白質組學從整體角度分析在不同狀態(tài)下體內(nèi)蛋白質表達的動態(tài)演變過程，其研究方法與傳統(tǒng)中醫(yī)強調(diào)人與社會環(huán)境的整體觀、辨證施治等思想相符合［3］。將差異蛋白質組學研究方法應用于中醫(yī)藥領域，為傳統(tǒng)中醫(yī)的研究打開一扇新的大門。

差異蛋白質組學的核心在于篩選、鑒定并驗證差異表達蛋白質，隨后從生物信息學、系統(tǒng)生物學角度分析差異表達蛋白。雙向電泳(2－DE)、質譜技術(MS)、蛋白質芯片是蛋白質組學技術的基礎，蛋白質數(shù)據(jù)庫、生物信息學和系統(tǒng)生物學為蛋白質組學研究結果的解譯提供信息支撐。差異蛋白質組學在中醫(yī)藥學科可廣泛應用于中醫(yī)證候、中藥及針灸等領域。

1 中醫(yī)證候學

中醫(yī)證候是疾病過程中某一階段或某一類型的病理概括，一般由1組相對固定、有內(nèi)在聯(lián)系且能揭示疾病某一階段或某一類型病變本質的癥狀和體征構成，可以反映病變的機理和發(fā)展趨勢。其功能的實現(xiàn)以物質為基礎，微觀水平的蛋白質表達及翻譯后修飾是機體整體功能狀態(tài)的物質基礎。

1.1 研究路線

圖1顯示，通過某一證型對比健康群體、相同疾病不同證型、不同疾病相同證型、不同疾病相類似證型或同一患者不同證候階段的差異蛋白質組學分析，鑒定出差異蛋白點，結合生物信息學分析，探索證候的分子生物學實質，促進證候學研究的現(xiàn)代化進程，為中醫(yī)辨證提供定量化、客觀化的蛋白質組學依據(jù)，或以證型間相對固定的差異蛋白為基礎，建立此類差異蛋白為生物標記物的證候模型，進一步指 導治法方藥作用機理的研究。

圖1 中醫(yī)證候學的差異蛋白質組學研究路線

1.2 對比健康群體證候實質研究

研究者嘗試通過氣虛血瘀模型［4］、脾陰虛模型［5］對比假手術組和正常組大鼠探索相應的證候實質。根據(jù)研究結果推測氣虛血瘀證實質可能與能量代謝障礙(蘋果酸脫氫酶、磷酸丙糖異構酶)、氧化損傷(谷胱甘肽過氧化物酶、NADH脫氫酶的鐵硫蛋白8)和缺血心肌保護的應激反應(αB－晶狀體蛋白)有關，但其生物信息學分析尚不完善，也未進行后期驗證。而脾陰虛的研究中僅提取出模型大鼠與正常大鼠海馬組織的差異蛋白點，尚未進行差異蛋白鑒定及驗證相關工作。此外，劉希成等［6］對比老年腎陽虛人群和老年健康人群血清樣本，發(fā)現(xiàn)并鑒定驗證8類49種差異表達蛋白(如免疫應答相關GA結合蛋白α鏈、鈣調(diào)蛋白功能相關降鈣素前體蛋白)。但此研究并未提供2組血清提供者的相關信息，無法確定此類差異蛋白是否為腎陽虛的特異性蛋白。

1.3 同病異證

此類研究在冠心?。?］(心氣虛和痰濁內(nèi)阻證)、慢性腎衰竭［8］(濕證和非濕證)等病種中已有相關報道。研究結果提示，心氣虛和痰濁內(nèi)阻證冠心病患者(各9例)的血清蛋白表達水平在血液連鎖反應系(補體成分C3、抗凝血酶III等)及血脂代謝(載脂蛋白H、載脂蛋白E等)等體內(nèi)代謝通路方面均表現(xiàn)出差異，而慢性腎衰竭可由4個尿液差異蛋白峰(m/z分別為 8654.96、2081.65、18667.3、2242.14)組成的生物標記物，將中醫(yī)濕證組和非濕證組樣本較好地分類，但未能通過數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)關聯(lián)蛋白鑒定。

1.4 異病同證、同類證

值得推崇的是，熊新貴等［9］嘗試通過4種不同疾病的不同證型，腦出血(肝陽化風證和陰虛風動證)、腦梗死(肝陽化風證和陰虛風動證)、頸椎病(肝陽化風證和肝陽上亢證)和帕金森病(肝陽化風證和血虛生風證)探索同病異證、異病同證、同類證(肝陽化風、血虛生風、陰虛風動)的實質，發(fā)現(xiàn)同病異證之間的相同蛋白少、差異蛋白多，不同疾病的肝陽化風證有13種共同表達蛋白(核糖核酸核蛋白K、硫氧還蛋白過氧化物還原酶、凝血酶1、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等)，不同疾病的相類似證候(肝陽化風證、陰虛風動證、血虛生風證)也存在相同的蛋白表達(硫氧還蛋白依賴性過氧化物酶TPx)。根據(jù)研究結果推測，相同疾病不同發(fā)展階段的不同證候具有相對特異的物質基礎(差異表達的蛋白)，不同疾病的相同證候或相類似證候源自于共同的物質基礎。

目前尚無研究者從同一患者不同證候階段的差異蛋白質組學角度進行證候實質性研究。

2 中藥學

中藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中最偉大的寶庫之一，但中藥本身的復雜性、來源的多樣性及多以復方為主的臨床應用模式都為中藥現(xiàn)代化研究提出了嚴峻挑戰(zhàn)，對這種多靶點、多環(huán)節(jié)、多層次的中藥現(xiàn)代化研究，應通過多角度、多技術、多學科交叉的方式進行。

2.1 研究路線

圖2顯示，結合藥物療效差異分析，中藥的差異蛋白質組學分析可從2個方向進行，即從藥物本身物質基礎方面進行中藥炮制及道地性等研究，為中藥鑒定、質量控制提供實驗基礎;以藥物不同部位為切入點進行差異蛋白質組學分析，有可能提高藥物原材料利用率;或是比較中藥干預前后、不同藥物干預、不同組方藥物、不同劑量藥物干預后受試體的效應相關樣本的差異表達蛋白，再進行藥效與差異表達蛋白的關聯(lián)性分析，探索有效成分、靶點蛋白等作用機制，并有可能建立量效關系和優(yōu)化中藥處方。此外，將證候與中藥結合進行差異蛋白質組學分析，也可為方－證相關提供分析生物學水平的理論支撐。

2.2 藥材炮制及道地性研究

李冰寧等［10］發(fā)現(xiàn)，炮制會影響水蛭蛋白質含量及存在形式，影響其抗凝作用，推薦鮮品入藥。盡管此研究所選藥物品種并不具有代表性，且缺乏完善的研究路線，但卻為中藥炮制學今后的研究方法提供了方向性依據(jù)。包華音等［11］分析不同產(chǎn)地壁虎及其肢體不同部位的水溶性蛋白質，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地壁虎同一部位、同一產(chǎn)地不同部位壁虎的蛋白質含量都存在差異，但未深入分析其差異蛋白質種類及其與藥性的關系。

目前尚無研究者利用差異蛋白質組學分析進行中藥道地性研究，且尚未形成以藥物蛋白質組學為基礎的藥材質量控制標準。

圖2 中藥學的差異蛋白質組學研究路線

2.3 藥物作用機制及靶點研究

劉鵬等［12］研究清熱解毒涼血化瘀浸膏對內(nèi)毒素肝損傷大鼠蛋白質表達的影響，推測中藥干預組中高表達(相對分子質量為4200道爾頓)和低表達(8984道爾頓、9005道爾頓)蛋白質可能是清熱解毒涼血化瘀干預內(nèi)毒素肝損傷大鼠的重要分子機制。鄭健、艾斯等［13－14］探索腎康靈對阿霉素腎病大鼠血清和尿液蛋白質譜表達的影響，推測血清差異表達蛋白(m/z分別為8837.7、15013.0、15053.2)和尿液差異表達蛋白(m/z分別為9321.0、9393.1、9477.5)，可能為中藥腎康靈靶向作用的蛋白點。上述研究者提出考慮進一步鑒定差異蛋白質，并結合臨床驗證差異蛋白的藥物靶向性，但目前并未見后續(xù)研究報道。

2.4 方－證相關

胡小勤等通過高血壓病氣虛血瘀證患者對比健康者血清進行補陽還五湯與高血壓病氣虛血瘀證“方證相關”研究，發(fā)現(xiàn)鑒定出8個高血壓病氣虛血瘀證患者與健康對照者差異蛋白點(上調(diào)蛋白肽基脯氨酰異構酶A、肽基脯氨酸順反異構酶A樣1亞型等，下調(diào)蛋白丙酮酸激酶同工酶M1亞型、抑制蛋白－1等)，而補陽還五湯含藥血清處理后與空白血清處理后的差異蛋白點共3個(上調(diào)蛋白丙酮酸激酶CRA－c亞型、熱休克蛋白27，下調(diào)蛋白膜蛋白A1，CRA－b亞型)，初步推測上述差異蛋白可能為補陽還五湯對高血壓氣虛血瘀證的作用靶點，其作用機制為抑制細胞凋亡［15］。

目前尚無研究者從不同藥物、不同組方或是不同劑量干預后的樣本差異蛋白質組學角度探索中藥作用機制。

圖3 針灸學的差異蛋白質組學研究路線

3 針灸學

經(jīng)絡腧穴理論及針灸是中國數(shù)千年歷代醫(yī)家累積的另一份寶貴財富，已在國際醫(yī)療衛(wèi)生保健領域占有一席之地。針灸的治療作用是建立在腧穴經(jīng)絡理論的基礎上的。20世紀以來，研究者不斷通過各種方法試圖解釋腧穴經(jīng)絡針灸的內(nèi)涵。盡管目前尚未形成可以完全解釋針灸學原理的框架，但困難并不能阻止研究者在針灸學領域的不斷探索。

3.1 研究路線

圖3顯示，有研究者通過穴位、經(jīng)絡通路沿線、非特異性組織和臟腑組織之間蛋白質組成的異同點及其針刺前后相關位置蛋白質組成種類與數(shù)量異同分析，嘗試尋找經(jīng)穴特異性、經(jīng)穴循經(jīng)特異性、經(jīng)穴臟腑相關的物質基礎。也有通過針刺干預前后特定效應相關物質蛋白質表達水平的變化，探討針灸作用于特定疾病的機理。此外，可以考慮通過不同的穴位組合(不同的經(jīng)絡選穴、經(jīng)驗用穴、辨證選穴等)、不同的刺激方法(電針、手針、灸法等)或不同的刺激量(提插補瀉、不同頻率等)干預前后療效分析結合差異蛋白質組學分析，研究經(jīng)穴效應循經(jīng)特異性、針刺量效關系，并為針灸治療方案標準化提供理論依據(jù)。

3.2 經(jīng)穴特異性、經(jīng)穴臟腑相關

張小卿、李春日等［16］對Wistar大鼠太溪穴、非經(jīng)非穴處結締組織和腎臟組織進行比較分析，發(fā)現(xiàn)腎臟－太溪穴的相關蛋白點多于腎臟－非經(jīng)非穴相關蛋白點，初步推測腎經(jīng)原穴太溪與其所屬臟腑腎臟之間的密切聯(lián)系與蛋白質有關。隨后他們［17］發(fā)現(xiàn)，針刺足少陰腎經(jīng)太溪穴可以影響腎臟蛋白質組學，上調(diào)能量代謝相關蛋白(NAD依賴性異檸檬酸脫氫酶)和醌相關抗氧化相關蛋白(醌還原酶)，進一步證實太溪穴與腎臟的聯(lián)系。幾位研究者采用漸進式研究思路，從初步探索到確定方向深入研究，是中醫(yī)藥理論基礎研究的重要路線。

3.3 針灸療效作用機制

Pan等［18］發(fā)現(xiàn)，電針對缺血性中風的神經(jīng)保護調(diào)節(jié)機制可能為激活多種補體(上調(diào)補體1、C3、C4B，下調(diào)絲氨酸蛋白酶抑制因子G1)，抑制細胞凋亡和抗血栓形成(上調(diào)β－2糖蛋白1)，并可能通過上調(diào)凝溶膠蛋白促進四肢肌力恢復。Gao等［19］通過電針足三里和陽陵泉治療大鼠慢性壓迫性損傷所致的神經(jīng)性疼痛的實驗，推測電針止痛效果是通過調(diào)控有關氨基酸代謝的海馬蛋白(如天冬氨酸轉氨酶1等)和激活促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路(如髓鞘堿性蛋白MBP)。XU等［20］對針刺前后哮喘大鼠肺部組織蛋白質組進行分析，發(fā)現(xiàn)針灸在不同水平上通過多個節(jié)點蛋白質調(diào)節(jié)炎癥信號通路(下調(diào)S100A8、RAGE、S100A11等促炎蛋白質，上調(diào)CC10、ANXA5、sRAGE等抗炎蛋白)，對這些炎癥相關蛋白的調(diào)節(jié)至少部分介導針灸的平喘效果。Lai等［21］發(fā)現(xiàn)，針刺對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓效果可能是通過上調(diào)SHR大鼠延髓中的抗氧化酶(谷氨酸脫氫酶1、醛脫氫酶2、超氧化物歧化酶等)實現(xiàn)的。

目前差異蛋白質組學應用于針灸領域的研究質量相對較高，成果更為顯著，但也僅限于針對針灸治療特定病種機制研究，并未就針灸特色理論(如不同穴位組合、不同的刺激方法、不同刺激量)有更好的發(fā)揮。

4 總結

差異蛋白質組學在中醫(yī)藥領域應用極具研究價值，但目前尚存在一定的局限性:首先是技術方面，蛋白質組學技術在蛋白質分離、鑒定、自動化方面仍需不斷完善，在大數(shù)據(jù)處理、生物信息學分析和系統(tǒng)生物學分析等方面也存在極大的挑戰(zhàn)，且試驗費用相對高昂，廣泛推廣受限。其次，當前研究路線多不完整，不能完全發(fā)揮差異蛋白質組學的優(yōu)勢(確定差異蛋白點－關聯(lián)差異蛋白－差異蛋白驗證－生物信息學分析)。再次，目前中醫(yī)藥領域的蛋白質組學研究多是動物實驗，臨床研究的總數(shù)和單個研究的樣本量都較少，動物實驗結果缺乏臨床驗證過程，這一現(xiàn)狀影響研究結果的準確性、靈敏度和特異性，直接導致結果的推廣受限。最后，中醫(yī)藥領域研究的參與者多數(shù)為中醫(yī)藥方面專業(yè)人員，因此對生物信息學、系統(tǒng)生物學知識掌握的深度和廣度有限，所以往往在得出結果后分析不夠完善，未能達到豐富中醫(yī)藥理論內(nèi)涵的目的。

中醫(yī)藥作為中國醫(yī)學的知識寶庫，尚有很多精髓有待繼續(xù)研究。差異蛋白質組學的應用尚有許多問題不容忽視，但隨著技術的不斷發(fā)展，生物信息學和系統(tǒng)生物學研究的深入，研究路線的不斷改善，多學科合作的廣泛開展，差異蛋白質組學將為中醫(yī)藥特色理論的解讀做出獨特貢獻。

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Research Route and Application in Differential Proteomics in Traditional Chinese Medicine

LI Li1，F(xiàn)AN Xiao－nong2，F(xiàn)U Jing－jing3，SHEN Yan2，WANG Shu2△
(1．Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 2．The First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China; 3．Hiser Medical Group of Qingdao，Qingdao 266000，China)

Differential proteomics，focusing on overall differentially expressed protein，correspond to essential idea of traditional Chinese medicine—holism.The authors proposed few research strategies for the proteomic studies in 3 basic fields of Chinese medicine—diagnosis(for instance，essence of TCM syndrome，same disease with different syndromes，different diseases with same syndrome，and similar TCM syndromes)，Chinese materia medica(processing of Chinese medicine，geo－h(huán)erbalism，drug target，and formula－syndrome correlation)and acupuncture and moxibustion(acupoint specificity，dose－effect relationship，acupoint－internal organ correlation and mechanism of acupuncture)，furthermore，summarized current status of differential proteomics in the research of traditional Chinese medicine and pointed out several limitations based on current reports.

Differential proteomics;Research strategy;Syndrome of TCM;Chinese materia medica;Acupuncture and moxibustion

R22

:A

:1006－3250(2015)12－1602－05

2015－02－19

國家973項目(2012CB518505);天津市高等學?？萍及l(fā)展基金計劃項目(20100221);高等學校博士學科專項科研基金(2011120110001)

李 禮(1990－)，女，安徽人，在讀碩士，從事針灸作用機制及針灸治療高血壓作用機理的臨床與研究。

△通訊作者:王 舒(1965－)，男，山東人，教授，醫(yī)學博士，從事針灸治療中風、偏頭痛及高血壓作用機理的臨床與研究，Tel:022－27432207，E－mail:wangs2008@163.com。