段世華 ，鄭 卓，顏紅宇，賀 俐，廖信軍

(1.井岡山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 吉安 343009;2.井岡山大學(xué) 生態(tài)環(huán)境與資源研究所，江西 吉安 343009;3.井岡山大學(xué) 醫(yī)務(wù)所，江西 吉安 343009)

細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)是一種由于雄性生殖系統(tǒng)退化不能產(chǎn)生花粉或產(chǎn)生的花粉缺乏正常功能的母性遺傳性狀，廣泛存在于高等植物中。水稻的細(xì)胞質(zhì)雄性不育及其育性恢復(fù)系統(tǒng)是雜交水稻生產(chǎn)與利用的基礎(chǔ)。自上個世紀(jì)70年代我國科學(xué)家在野生稻中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)雄性不育并成功實現(xiàn)雜交水稻的三系配套以來，三系法雜交水稻生產(chǎn)技術(shù)的應(yīng)用為解決我國乃至世界糧食危機做出了巨大的貢獻［1-2］。目前科學(xué)家在水稻中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種類型的CMS，其中野敗型(WA-CMS)、紅蓮型(HL-CMS)和包臺型(BT-CMS)是公認(rèn)的3種主要水稻CMS類型［3］，被廣泛應(yīng)用于雜交水稻組合的培育，并在生產(chǎn)上得到大面積的應(yīng)用［4-7］。研究表明，與大多數(shù)高等植物的CMS相類似，水稻CMS現(xiàn)象的產(chǎn)生也與其線粒體基因組異常嵌合基因的形成有關(guān)［8-13］。近年來國內(nèi)外多個科研小組對水稻CMS及其育性恢復(fù)的機理進行了廣泛而深入的研究，但到目前為此，只有BT-CMS和HL-CMS的分子機理研究得較為清楚。早在1994年，Akagi等［11］研究發(fā)現(xiàn)BT-CMS系線粒體atp6基因下游的一段特殊序列與BT-CMS有關(guān)，并將存在該區(qū)域的一個能編碼79個氨基酸的可讀框命名為orf79。之后國內(nèi)外多個研究小組對BT-CMS/Rf系統(tǒng)的分子機理進行了深入系統(tǒng)的研究，并證實orf79為BT-CMS基因［14-16］。2002年Yi等［13］發(fā)現(xiàn)水稻HL-CMS系線粒體atp6基因下游也存在一個與BT-CMS基因orf79具有97%同源性的特殊可讀框，定名為orfH79。2010年P(guān)eng等［17］通過轉(zhuǎn)基因研究證實orfH79為HL-CMS基因。在此基礎(chǔ)上，Hu等［18］和Wang等［19］分別從不同的角度對HL-CMS/Rf系統(tǒng)的分子作用機制及orfH79的功能進行了深入的探討，并對HL-CMS/Rf系統(tǒng)的分子機理做了系統(tǒng)的闡述。毋庸置疑，HL-CMS基因orfH79和BT-CMS基因orf79的研究證實及其功能的闡述，對進一步加強水稻CMS胞質(zhì)資源的發(fā)掘與利用具有非常重要的理論與實踐意義。

在三系雜交水稻育種實踐中，優(yōu)良的水稻CMS系是培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)組合的必要條件，因此，發(fā)掘培育不同來源和類型的優(yōu)良水稻CMS系，對豐富水稻CMS胞質(zhì)的類型，避免因單一胞質(zhì)而帶來的生產(chǎn)風(fēng)險意義重大［20-21］。農(nóng)作物近緣種是作物遺傳改良與利用的重要種質(zhì)資源，生產(chǎn)上和容易通過有性雜交的手段轉(zhuǎn)移這些種質(zhì)資源中的有利基因［22］。過去幾十年，育種家利用各種手段培育了一系列的水稻CMS系，為雜交水稻的可持續(xù)發(fā)展做出了重大的貢獻。目前，生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的水稻CMS胞質(zhì)大多數(shù)是來源于與水稻近緣的野生稻品種或性狀原始的農(nóng)家種［23］，因此，推測水稻種質(zhì)資源中應(yīng)該蘊含有豐富的CMS胞質(zhì)資源。HL-CMS胞質(zhì)來源于紅芒野生稻［23］，但其是否在其它水稻種質(zhì)資源中具有分布?如果具有分布它們是保守性遺傳還是產(chǎn)生了遺傳分化?非常值得去研究與探討。為此本研究以水稻HLCMS基因orfH79為特異性分子標(biāo)記，對來自不同稻作國家的124份水稻材料進行篩選，在探明HL-CMS基因orfH79在水稻種質(zhì)資源中分布的基礎(chǔ)上，通過對相關(guān)水稻材料中HL-CMS基因orfH79及其同源序列的克隆和序列分析，闡明其在稻種資源中的遺傳特點及變異模式，為新水稻CMS胞質(zhì)的發(fā)掘和利用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

來自不同稻作國家的 124份水稻材料(包括 O.nivara(21)、O.rufipogon(25)、O.glumaepatula(5)、O.longistaminata(4)、O.meridionalis(4)、O.barthii(4)、O.glaberrima(8)和 O.sativa(53))用于 HL-CMS 基因orfH79為特異分子標(biāo)記的篩選，共篩選出18份具有HL-CMS基因 orfH79或其同源序列的水稻材料用于本研究。供試材料中具有IRGC種質(zhì)庫品系號(IRGC Acc.No.)的水稻材料種子來自菲律賓國際水稻所種質(zhì)資源中心，其它水稻材料的種子由本實驗室提供。所有水稻材料均種植于井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物園試驗田或溫室中。

1.2 水稻材料總DNA的提取

研究已經(jīng)證實水稻HL-CMS基因orfH79為其線粒體atp6基因下游特有嵌合片段，在細(xì)胞核中不存在其拷貝［13］。為了進一步確證水稻核基因組中不存在其完整拷貝，利用BLAST工具在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別對秈稻(9311)和粳稻(Nipponbare)核基因組進行序列搜索，結(jié)果均沒有搜索到HL-CMS基因orfH79完整序列拷貝。為此，本研究提取各水稻材料總DNA為orfH79片段的特異性擴增模板，DNA提取方法采用Doyle［24］修改的CTAB法，具體操作詳見文獻［24］。

1.3 PCR 擴增

根據(jù)水稻 HL-CMS基因 orfH79編碼區(qū)保守序列設(shè)計特異性 PCR擴增引物對:PF:5′-TGACAAATCTGCTCCGATG-3′;PR:5′-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3′。以篩選出的18份水稻材料的總 DNA為模板對orfH79片段進行特異性PCR擴增。PCR反應(yīng)體積為25 μL，其中Taq DNA聚合酶1.0 U(TAKARA)，MgCl21.5mol/L，10×PCR 緩沖液 2.5 μL，dNTPs 200 μmol/L(TAKARA)，DMSO 1 μL，模板DNA 60 ng，上下游引物均為 0.2 μmol/L，PCR 程序為 94 ℃ 變性 5 min;94 ℃，45 s，55 ℃，60 s，72 ℃，60 s，30個循環(huán);72℃延伸10 min。

1.4 擴增DNA產(chǎn)物的回收、克隆與測序

所有水稻材料的DNA擴增產(chǎn)物在15 g/L瓊脂糖凝膠上進行電泳分離，紫外燈下割膠后，用DNA膠回收試劑盒(Axyprep DNA，Axygen，Beijing)進行擴增DNA片段的回收與純化，具體操作按DNA膠回收試劑盒說明書進行?；厥盏母魉静牧蟧rfH79 DNA片段分別連接于pGM T-vector(Tiangen，Beijing)，受體菌為DH5α。在含氨芐青霉素的選擇性固體培養(yǎng)基上進行細(xì)菌培養(yǎng)。挑選3～5個陽性克隆對目標(biāo)片段進行PCR驗證。每個水稻材料挑選3個經(jīng)PCR驗證的陽性克隆進行測序。DNA序列測定由上海生工公司完成。

1.5 序列分析及聚類分析

所有水稻材料的DNA序列以CLUSTAL-X軟件進行比對并輔以人工校正［24］。聚類分析采用Mega6.0版軟件［25］中的鄰接(Neighbor-joining，N-J)法進行。DNA序列之間的遺傳距離按照Maximum Composite Likelihood model模型計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 HL-CMS基因orfH79及其同源序列在稻種資源中的分布

為了探明HL-CMS基因orfH79及其同源序列在水稻資源中的存在，利用開放閱讀框orfH79片段的保守區(qū)設(shè)計特異性PCR擴增引物對:PF和PR，對來自不同稻作國家的124份水稻材料進行PCR檢測，結(jié)果獲得18份具有orfH79片段的水稻材料(見表1)。18份水稻材料包括3份一年生普通野生稻(O.nivara)、3 份多年生普通野生稻(O.rufipogon)、2 份展穎野生稻(O.glumaepatula)、5 份栽培水稻(O.sativa L.)和 5 份栽培稻農(nóng)家種(O.sativa landrace)，它們分別來自中國(4)、印度(4)、孟加拉(2)、喀麥隆(2)、斯里蘭卡(2)、巴西(1)、蘇里蘭(1)、菲律賓(1)和美國(1)等9個稻作國家。結(jié)果表明HLCMS基因orfH79及其同源序列在稻種資源中具有較高頻率的存在(14.5%)，并廣泛分布于地球上的相關(guān)稻作地區(qū)。為了驗證篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，利用引物對PF和PR，對篩選出的18份水稻材料做了進一步的PCR驗證，結(jié)果顯示18份水稻材料均含有目標(biāo)片段(圖1)，驗證了本研究篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖1 引物對PF和PR在18份含有orfH79水稻材料的PCR擴增驗證Fig.1 orfH79 PCR validation of 18 rice materials by primer pairs PF and PR

表1 本研究篩選出的18份水稻材料信息Tab.1 Information of 18 selected rice materials used in this study

2.2 DNA堿基及多肽氨基酸變異分析

研究已經(jīng)證實水稻HL-CMS基因orfH79和BT-CMS基因orf79同為一個240 bp組成的開放閱讀框［11，13］。DNA序列比對分析顯示，本研究篩選出的18份水稻材料的orfH79片段及其同源序列和BTCMS基因orf79序列均為240 bp，且其保守性高達(dá)97%，有6個堿基多態(tài)性變異位點被檢測出。在檢出6個堿基變異位點中，第4和13位堿基，分別為A與G，C與G的變換，但這種變異為BT-CMS系Chinsurah Boro II所特有，表現(xiàn)出了BT-CMS基因orfH79與HL-CMS基因orf79在DNA水平上的重大差異;第142位堿基，表現(xiàn)為A與T之間的變換;第146位堿基為C、A變換;第147位堿基為A、T、C之間的變化;以及第178位堿基的C與T替換。其中第142、146和147位點表現(xiàn)為堿基的顛換，第178位點則為堿基的轉(zhuǎn)換。根據(jù)DNA序列變異信息，具HL-CMS基因orfH79片段的18份水稻材料可分為四個類群，BT-CMS基因orf79由于其存在2個特有堿基變異而單獨成為一類。各水稻材料orfH79/orf79或其同源序列堿基變換的詳細(xì)信息見表2。

研究表明水稻HL-CMS基因orfH79與BT-CMS基因orf79均編碼一個79氨基酸的多肽ORFH79［11，13］。根據(jù)氨基酸密碼子編碼信息顯示，本研究中包括BT-CMS系在內(nèi)的19份水稻材料的6個堿基變異導(dǎo)致多肽ORFH79/ORF79產(chǎn)生了5個氨基酸位點的改變(表2)。氨基酸序列比對分析表明多肽ORFH79/ORF79的第2和第5位密碼子分別產(chǎn)生了由ACA→GCA和CTC→GCT的變化，使BTCMS基因orf79編碼的多肽ORF79第2位和第5位氨基酸分別由蘇氨酸(Thr)突變?yōu)楸彼?Ala)，亮氨酸(Leu)突變?yōu)槔i氨酸，從而形成了BT-CMS基因orf79不同于其它18個含HL-CMS基因orfH79的多肽變異模式;第48密碼子產(chǎn)生了由ATG→TTG的突變，使其第48位氨基酸表現(xiàn)為甲硫氨酸(Met)與亮氨酸(Leu)間的變換;而第49密碼子表現(xiàn)為一種較復(fù)雜的多態(tài)性變異模式，分別形成GCA、GCT、GAA和GAC四種密碼子，由于GCA與GCT相互為同義密碼子，均編碼丙氨酸(Ala)，因此，多肽ORFH79/ORF79的第49位氨基酸表現(xiàn)為丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glue)和天冬氨酸(Asp)之間的多態(tài)性變異模式;第60密碼子則由CAC→TAC，產(chǎn)生組氨酸(His)與酪氨酸(Tyr)之間的轉(zhuǎn)變。同時根據(jù)多肽ORFH79/ORF79氨基酸的變異信息，包括BT-CMS系在內(nèi)的19份水稻材料可分為四個類群，其中BT-CMS系由于其獨特的多肽變異模式而單獨稱為一類(表2)。

表2 18份水稻材料的orfH79/orf79及其同源序列和的DNA與氨基酸序列變異分析Tab.2 Analysis of DNA and amino acid variation for orfH79/orf79and its homologous sequences in 18 rice materials

2.3 聚類分析

利用Mega6.0軟件根據(jù)包括BT-CMS系“Chinsurah Boro II”在內(nèi)的19份水稻材料的orfH79/orf79及其同源序列數(shù)據(jù)進行聚類分析(圖2)。結(jié)果顯示，DNA序列的變異使18份含HL-CMS基因orfH79的水稻材料形成了四個類群:野生稻“101978”、“105661”和栽培稻品種“Lemont”、“Jingxi 17”、“Azuzena”與HL-CMS系“Yuetai A”的orfH79序列變異一致而聚在了一起形成第i類群;兩個一年生普通野生稻(O.nivara)“10971”、“103419”與 1 個多年生普通野生稻(O.rufipogon)“104599”以及展穎野生稻(O.glumaepatula)“100968”聚在了一起組成第ii類群;5個栽培稻農(nóng)家種(O.sativa landrace)“77276”、“77263”、“47078”、“56681”和“67708”一致地聚在一起與栽培稻“V20B”構(gòu)成了第 iii類群;多年生普通野生稻品種“104057”與“105349”聚為第iv類群。BT-CMS系“Chinsurah Boro II”由于其獨特的序列變異模式而單獨成為一支。但從多肽ORFH79氨基酸的變異來看，由于第iv類群的2個多年生普通野生稻品種“104057”與“105349”的第49密碼子(GCT)與第iii類群6個栽培稻品種的第49密碼子(GCA)相互為的同義密碼子，所以根據(jù)氨基酸序列變異信息，18份含HL-CMS基因的水稻材料則被分成了3個類群(圖2I、II、III)。多肽ORF79由于其特有的氨基酸變異模式而使BT-CMS系“Chinsurah Boro II”單獨成為IV類。堿基變異導(dǎo)致基因功能的改變，通常是由其變異的多肽或蛋白質(zhì)表現(xiàn)出來，因此，根據(jù)氨基酸序列的變異可以推測HL-CMS胞質(zhì)在水稻資源中至少分化出3種變異類型。

圖2 基于19份水稻材料的orfH79/orf79及其同源序列構(gòu)建的聚類分析Fig.2 A clustering tree of 19 accessions rice materials based on orfH79/0rf79 and its homologous sequences

3 討論

3.1 HL-CMS基因orfH79及其同源序列在水稻資源中的分布

在當(dāng)前水稻生產(chǎn)實踐中，由于三系法雜交稻穩(wěn)定的育性和完善的技術(shù)體系，其在生產(chǎn)上依然具有非常重要的地位，因此，發(fā)掘與培育新型水稻CMS系，對豐富水稻CMS胞質(zhì)，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交稻組合具有重大的意義［3］。生產(chǎn)上利用遠(yuǎn)緣雜交進行水稻CMS系的選育，是新水稻CMS系培育的主要方式。研究已經(jīng)證實線粒體異常嵌合基因orfH79為HL-CMS基因［15-19］。利用水稻CMS基因為特異選擇標(biāo)記，以檢測水稻資源中相應(yīng)不育胞質(zhì)的存在，是發(fā)掘與培育新水稻CMS系最為快捷有效的方法［20］。水稻HL-CMS胞質(zhì)來源于紅芒野生稻［23］，推測其在水稻資源中，特別是野生近緣種或農(nóng)家種中應(yīng)該廣泛的存在。本研究利用HL-CMS基因orfH79為特異分子標(biāo)記對來自不同稻作國家的124份水稻材料進行篩選，結(jié)果顯示HL-CMS基因orfH79在水稻資源中(包括野生稻、栽培稻以及農(nóng)家種)確實具有較高頻率的分布。篩選的18份水稻材料分別來自9個不同的稻作國家，這也表明其具有廣泛的地理分布。然而HL-CMS基因orfH79在野生稻和栽培稻中的這種高頻率分布，除了引起雄性不育外，是否還有其他方面重要作用，這是一個非常值得去進一步深刻探究的問題。

3.2 HL-CMS基因orfH79及其同源序列的變異多態(tài)性

眾所周知，發(fā)生在基因編碼區(qū)的堿基變異可能會導(dǎo)致其編碼氨基酸的變化，從而產(chǎn)生多肽或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變異，最終可能引起多肽或蛋白質(zhì)功能的改變［24］。Yi等［13］2002年研究證實水稻HL-CMS基因orfH79與BT-CMS基因orf79在編碼序列上高度同源(具97%的同源性)，它們之間僅存在6個堿基的替換，并導(dǎo)致多肽ORFH79與ORF79之間產(chǎn)生5個氨基酸的變異。然而正是由于這6個堿基及5個氨基酸的變異導(dǎo)致HL-CMS與BT-CMS表現(xiàn)出明顯不同的花粉敗育表型(前者為園敗，后者為染敗)，并產(chǎn)生了不盡相同的敗育機制［15-19，27-28］。本研究對篩選出的18份水稻材料以及BT-CMS系“Chinsurah Boro II”的orfH79/orf79及其同源序列進行了分析，結(jié)果顯示HL-CMS基因orfH79和BT-CMS基因orf79及其同源序列在水稻資源中確實具有非常保守的遺傳特性(同源性達(dá)97%)。18份含HL-CMS基因orfH79及其同源序列的水稻材料僅檢測出4個多態(tài)性堿基變異位點，這4個多態(tài)性變異位點可將這18份水稻材料分成4個類群。氨基酸序列變異分析顯示4個堿基位點的替換導(dǎo)致多肽ORFH79產(chǎn)生了3個氨基酸的變異，并將18份水稻材料分為3個類群。DNA和氨基酸序列的聚類結(jié)果也進一步表明，HL-CMS基因與BT-CMS基因?qū)儆诓煌愋桶|(zhì)不育基因，這一點在以往的研究中已經(jīng)得到了證實［15-19，27-28］。另外有趣的是，從聚類結(jié)果來看，栽培稻品種和農(nóng)家種分別聚在了一起，而野生稻品種則表現(xiàn)為多樣性的變異特點，說明栽培稻存在明顯的人工選擇傾向，也進一步表明HL-CMS基因orfH79在栽培稻中除了引起雄性不育外，可能還有其他方面重要作用。根據(jù)多肽氨基酸序列的變異模式，我們可以看出HLCMS胞質(zhì)在水稻資源中可能分化出至少3種以上的變異類型，然而這些不同的變異類型是否導(dǎo)致不同的敗育機制，也非常值得進一步深入去探究。

致謝:菲律賓國際水稻研究所種質(zhì)資源中心Guzman Flora博士提供了所有的野生稻材料和部分栽培稻材料，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)賀浩華教授、江西師范大學(xué)謝建坤教授為本文的修改提出了寶貴建議，謹(jǐn)致謝意!

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