李 霖，劉 冰，陳秀潤，崔朝宇，蔣軍喜*，胡瓊波*

(1.江西農業(yè)大學 農學院，江西 南昌 330045;2.華南農業(yè)大學 資源環(huán)境學院，廣東 廣州 510510)

玫煙色棒束孢(Isaria fumosorosea)(又稱玫煙色擬青霉Paecilomyces fumosoroseus)是一類分布廣泛的昆蟲病原真菌，也是目前已知頗具應用前景的溫室害蟲生防真菌之一［1－2］;在國外已有PreFeRal、PF97等多個玫煙色棒束孢生防藥劑登記注冊［3－4］。然而從昆蟲尸體上分離篩選出的野生菌株往往由于防效不穩(wěn)定、毒力易退化等原因，限制了其田間的實際應用［5－6］。因此，需進一步篩選優(yōu)良菌株，采用細胞工程、基因工程等多種生物技術對菌株進行改良，進而獲得高效工程菌株，為開發(fā)玫煙色棒束孢殺蟲劑提供一種有效的途徑。

外源基因轉化是進行玫煙色棒束孢基因工程改良的關鍵步驟之一，其前提條件是能獲得該菌大量原生質體細胞和具有高效的基因轉化方法。目前較為常見的基因轉化方法有原生質體－PEG法、農桿菌介導轉化法［7］、醋酸鋰轉化法、限制酶介導轉化法［8］、電轉化法［9］等，其中應用于絲狀真菌轉化系統(tǒng)構建多采用原生質體－PEG法，并且該方法已在若干實驗菌株中成功應用［10－11］。

2012年，本實驗室研究人員從田間煙粉虱(Bemisia tabaci)尸體上分離到一株蟲生真菌(Isaria fumosorosea)，命名為菌株IfB01，前期實驗表明該菌株對煙粉虱有較強的毒力［12］，考慮到其良好的生防應用前景，本研究擬采用原生質體－PEG法構建起玫煙色棒束孢IfB01菌株外源基因轉化系統(tǒng)，并對其原生質體制備和轉化條件進行了初步探索，為下一步利用細胞工程、基因工程等技術對菌株進行遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與含有外源基因載體 玫煙色棒束孢(Isaria fumosorosea)IfB01菌株，由華南農業(yè)大學農藥毒理實驗室提供，pSilent－1質粒由美國FGSC中心惠贈。

1.1.2 試劑及配制 (1)試劑:不同濃度的NaCl滲透壓穩(wěn)定劑溶液;(2)蝸牛酶(Snailase)、纖維素酶(Cellulase)分別購自BBI公司和Worthington公司，按試驗要求稱取一定量的酶溶于配制的特定濃度的穩(wěn)滲劑中，經0.45 μm細菌濾器過濾除菌，4℃下保存?zhèn)溆?(3)潮霉素B購自Roch公司;(4)NaNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、NaCl、蛋白胨、蔗糖等試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 (1)改良的察氏培養(yǎng)基:蛋白胨 5 g，NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，蔗糖 30 g，瓊脂 15～20 g，加蒸餾水至 1 L;(2)液體基礎培養(yǎng)基:改良的察氏培養(yǎng)基中不加瓊脂;(3)原生質體再生培養(yǎng)基:改良的察氏培養(yǎng)基加入相應的滲透壓穩(wěn)定劑;(4)原生質體保存 STC 培養(yǎng)液:1.2 mol/L 山梨醇，10 mmol/L Tris－HCl(pH 7.5)，50 mmol/L CaCl2;(5)PTC 轉化培養(yǎng)基:PEG4000，10 mmol/L Tris－HCl(pH 7.5)，50 mmol/L CaCl2。

1.2 方 法

原生質體制備參照Yoo［13］和李麗花等［14］的方法并作適當修改。

1.2.1 菌絲體制備 玫煙色棒束孢IfB01菌株于改良的察氏培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)2周;待產孢后，用0.05%的吐溫－80溶液沖洗平板，并配制成濃度為108個/mL的孢子懸浮液;取1 mL懸浮液接種于100 mL液體基礎培養(yǎng)基中，置于25℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)30 h;無菌條件下，用雙層紗布將菌絲過濾至100 mL離心管中;5 000 r/min，離心10 min，棄上清;用0.7 mol/L的NaCl溶液清洗2遍;并用無菌紙吸干沉淀，得到幼嫩菌絲體。

1.2.2 原生質體制備條件初探 (1)酶液配比。分別配制不同質量濃度的蝸牛酶、纖維素酶，然后按照等體積混合原則進行組合，共進行7種組合處理，分別是3%蝸牛酶、3%纖維素酶、1%蝸牛酶+2%纖維素酶、1.5%蝸牛酶+1.5%纖維素酶、2%蝸牛酶+1%纖維素酶、2%蝸牛酶+4%纖維素酶、4%蝸牛酶+2%纖維素酶7種酶解液，將酶解液按1 g/mL的量加入到幼嫩菌絲體中，進行酶解，制備原生質體。7種處理在同一試驗中完成，以減少誤差。在7種不同處理中，除酶種類不同外，其他試驗條件均相同:以0.7 mol/L的NaCl溶液為滲透壓穩(wěn)定劑、酶解溫度30℃、酶解pH6.0、在100 r/min轉速下振蕩酶解，每隔2 h在顯微鏡下觀察原生質體數(shù)量，直至酶解10 h。然后用血球計數(shù)板計數(shù)，分別計算原生質體產量(每mL酶液產生的原生質體數(shù)量，以原生質體個數(shù)/mL表示，下同)。(2)酶解時間。設定5個酶解時間:2，4，6，8，10 h。除酶解時間不同外，其他試驗條件均相同:以1%蝸牛酶+2%纖維素酶作為酶解液，0.7 mol/L的NaCl溶液為滲透壓穩(wěn)定劑、酶解溫度30℃、酶解pH6.0、在100 r/min轉速下振蕩酶解。在設定的5個時間點定時取樣，然后用血球計數(shù)板計數(shù)，分別計算原生質體產量。(3)酶解溫度。分別設定5個酶解溫度:26，28，30，32，34℃。除酶解溫度不同外，其他試驗條件同步驟(2)。在設定的不同溫度下酶解8 h。用血球計數(shù)板計數(shù)，分別計算原生質體產量。(4)酶液pH值。分別配制pH值5.0、5.5、6.0、6.5和7.0的0.2 mol/L磷酸緩沖液，在緩沖液中加入NaCl作為滲透壓穩(wěn)定劑，NaCl溶液的終濃度為0.7 mol/L，然后配制1%蝸牛酶和2%纖維素酶混合液，除酶液pH值不同外，其他試驗條件同步驟(2)。用血球計數(shù)板計數(shù)，分別計算原生質體產量。(5)滲透壓穩(wěn)定劑濃度。將供試的NaCl滲透壓穩(wěn)定劑分別設定 5 個濃度:0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mol/L。除滲透壓穩(wěn)定劑濃度不同外，其他試驗條件同步驟(2)。用血球計數(shù)板計數(shù)，分別計算原生質體產量。(6)轉速。分別設定5個不同轉速條件:0，50，100，150，200 r/min。除振蕩轉速不同外，其他試驗條件同步驟(2)。用血球計數(shù)板計數(shù)，分別計算原生質體產量。

1.2.3 原生質體的純化 菌絲酶解后，用4層滅菌的擦鏡紙過濾混合液;將濾液轉移至100 mL離心管中，4 000 r/min離心5 min;棄上清，0.7 mol/L的NaCl溶液沖洗2次;再用10 mL STC溶液洗滌1次;在離心管中加入1 mL STC溶液，輕輕混合均勻;用血球計數(shù)板計數(shù)。

1.2.4 原生質體轉化及轉化子篩選 在上述原生質體溶液中加入10 μL pSilent－1質粒，輕輕混合均勻;4℃冰箱內放置1 h;然后逐滴加入200 μL PTC溶液，室溫放置20 min;再逐滴加入800 μL PTC溶液，放入搖床中輕搖20 min;在離心管內加入5 mL液體再生培養(yǎng)基，置于25℃，150 rpm條件下振蕩培養(yǎng)過夜;將過夜的培養(yǎng)液離心，棄部分上清，并將培養(yǎng)液中原生質體濃度稀釋至104個/mL;取200 μL培養(yǎng)液(含原生質體濃度1×104個/mL)涂于含有200 μg/mL潮霉素B的原生質體再生培養(yǎng)基平板上，25℃條件下培養(yǎng)30 h，記錄平板上菌斑數(shù)，并計算原生質體轉化率。培養(yǎng)基上生長的菌落即為轉化子。原生質體轉化率計算公式:

轉化率=再生菌落數(shù)/涂布原生質體個數(shù)×100%(1)

1.2.5 原生質體轉化條件優(yōu)化 分別配制含20%、30%、40%、50%的 PEG4000的 PTC溶液，按照1.2.4方法分別進行原生質體轉化及轉化子篩選，統(tǒng)計各濃度下再生菌斑數(shù)，并計算各濃度下原生質體轉化率。

2 結果與分析

2.1 玫煙色棒束孢原生質體制備條件初探

2.1.1 酶液配比對原生質體制備的影響 真菌細胞壁成分結構復雜，選擇合適的酶系統(tǒng)對原生質體產量具有重要影響。為篩選到理想的酶組合，選用2種常用酶(蝸牛酶和纖維素酶)及其組合進行試驗，觀察其對原生質體產量的影響，結果表明，單獨進行纖維素酶或蝸牛酶處理的原生質體產量相差不大，但2種酶混合使用效果明顯好于單個酶處理。當混合酶系統(tǒng)中蝸牛酶∶纖維素酶=1∶2，酶的總濃度為30 mg/mL時，其原生質體產量最高，可達6.72×106個/mL。因此，玫煙色棒束孢菌株IfB01細胞壁的最適溶解酶系統(tǒng)為1%蝸牛酶+2%纖維素酶。

中共十九大報告指出：“我國社會主要矛盾已經轉化為人民日益增長的美好生活需要和不平衡不充分的發(fā)展之間的矛盾?！盵1]11美好生活理念的出場是對新時代美好生活需要的現(xiàn)實回應，也是人民對美好生活憧憬的價值取向。但美好生活究竟是什么樣、美好生活何以成為人通達意義世界的棲息之地，仍然是一個有待深入探討的問題。鑒于此，本文擬從馬克思人的解放理論的視角切入，闡釋美好生活的內涵和生成邏輯，以期為達成人民美好生活愿景提供理論坐標和路徑參考。

表1 酶的種類及配比對原生質體產量的影響Tab.1 Effects of category of enzymes and mixture ratio on the protoplast yield of I.fumosorosea

2.1.2 酶解溫度和酶解時間對原生質體制備的影響 對玫煙色棒束孢菌原生質體制備的最佳酶解溫度進行篩選，試驗結果如圖1－A所示，開始時隨著酶解溫度的增加，原生質體的產量逐漸增加，酶解溫度為30℃時，原生質體產量為最高，達到6.49×106個/mL，隨著酶解溫度的升高，原生質體產量下降逐漸下降。這一結果表明在一定溫度范圍內，隨著溫度的升高，復合酶的活性也在提高，原生質體的產量也隨之增加;當溫度過高時，復合酶的活性也會受到影響，進而影響原生質體產量。

比較不同酶解時間對玫煙色棒束孢菌原生質體制備的影響，結果如圖1－B所示，在供試時間內，玫煙色棒束孢菌原生質體產量隨酶解時間的延長而不斷升高，至8 h為最高點，產量達到6.65×106個/mL，之后開始呈下降的趨勢，所以8 h玫煙色棒束孢菌原生質體制備的最佳酶解時間。這一結果也表明酶解時間達到一定時間點后，酶解液會對菌株細胞膜造成破壞，進而造成細胞消溶死亡，導致原生質體產量下降。

2.1.3 酶解液pH值對原生質體制備的影響 由圖1－C可知，酶解液pH對玫煙色棒束孢菌原生質體制備存在一定的影響，在供試的5個pH處理中，當酶解液pH為6.0時，其原生質體產量最高，為5.50×106個/mL;此外，酶解液 pH 為 7.0 時，其原生質產量僅為 4.03×106個/mL。

2.1.4 穩(wěn)滲液濃度對原生質體制備的影響 穩(wěn)滲液濃度對玫煙色棒束孢菌原生質體的產量有較大的影響，開始時原生質產量隨著穩(wěn)滲液濃度的增大而增加，當濃度為0.7 mol/L時，其產量達到最大值，為5.83×106個/mL;而后隨著穩(wěn)滲液濃度的進一步增大，原生質體的產量隨之減少(圖1－D)。因此，玫煙色棒束孢菌原生質體制備時，其穩(wěn)滲液最佳濃度為0.7 mol/L。

圖1 不同酶解條件對原生質產量的影響Fig.1 Effects of different digestion conditions on the protoplast yield of I.fumosorosea

2.1.5 酶解時振蕩轉速對原生質體制備的影響 研究不同振蕩轉速對玫煙色棒束孢菌原生質體制備的影響，結果表明不同的振蕩轉速對IfB01菌株原生質體制備影響差異較小，當轉速為100 r/min時，其原生質體產量最高，為6.07×106個/mL;其振蕩轉速設置為0，50，200 r/min時，原生質體的產量分別是5.35×106個/mL、5.74×106個/mL、5.59×106個/mL。由此，將 100 r/min 條件確定為玫煙色棒束孢菌原生質體制備時最佳振蕩轉速條件。

2.2 玫煙色棒束孢原生質體轉化條件優(yōu)化

2.2.1 PEG4000濃度對原生質體轉化的影響 比較不同PEG4000濃度對玫煙色棒束孢原生質體轉化的影響，結果如表2所示，當PEG4000濃度為40%時，其轉化效率最高，達7.05%;當PEG4000濃度為20%時，其轉化效率僅為2.1%。結果表明PEG4000濃度對玫煙色棒束孢原生質體轉化效率有較大影響，其原生質體轉化最優(yōu)PEG4000濃度為40%。

表2 PEG4000濃度對原生質體轉化的影響Tab.2 Effects of the concentration of PEG4000 to protoplast transformation

3 結論與討論

由于絲狀真菌細胞壁組成比較復雜，不同種屬之間存在一定的差異，因此，在原生質體制備實驗中，細胞壁酶解體系組成及濃度是影響原生質體釋放的關鍵因素［15－16］。楊旭芬等［8］用蝸牛酶、裂解酶對玫煙色擬青霉Pfr116進行酶解獲得成功，但其最優(yōu)原生質體產量僅為1.11×106個/mL。本試驗比較了蝸牛酶、纖維素酶及其酶系組合對玫煙色棒束孢原生質體的釋放效果，發(fā)現(xiàn)不同脫壁酶處理均能使玫煙色棒束孢釋放出原生質，并且釋放效果存在明顯差異，多種酶組合比單種酶表現(xiàn)出更好的酶解效果，其中以1%蝸牛酶+2%纖維素酶酶解效果最好，其原生質產量達6.72×106個/mL。此外，蝸牛酶、纖維素酶在其他絲狀真菌原生質體制備實驗中也被廣泛應用，在本研究應用中也表現(xiàn)出較好的酶解效果，玫煙色棒束孢在不同酶系處理后均無大量團狀菌絲結構殘存。

在原生質體制備實驗中，除細胞壁酶解體系組成及濃度外，影響原生質體制備產量的因素還有菌絲菌齡、酶解溫度、酶解時間、pH和穩(wěn)滲液的濃度等［15］。經過對實驗結果的分析發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)滲液濃度對玫煙色棒束孢原生質體的產量有較大的影響，當穩(wěn)滲液濃度為0.7 mol/L時，其產量達到最大值，為5.83×106個/mL，這一試驗結果表明，穩(wěn)滲液濃度變化會對玫煙色棒束孢細胞水分吸收造成影響，進而影響其原生質體產量，當NaCl溶液濃度為0.7 mol/L時，其濃度與細胞內離子濃度相差不大，能為其細胞提供穩(wěn)定的生存環(huán)境。

在PEG介導真菌的原生質體轉化實驗中，PEG濃度是影響其轉化效率的重要因素［11］。本試驗比較了不同PEG濃度對玫煙色棒束孢原生質體轉化效率的影響，發(fā)現(xiàn)在一定范圍內，其濃度越高，介導效果越好，即轉化效率越高;但當其濃度過高時，PEG的毒性可能殺死細胞，反而造成原生質體轉化率降低。

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