王正樂，劉培釗，2 (.中國人民解放軍第7872 部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，河南 信陽 46400;2.第二軍醫(yī)大學(xué)研究生管理大隊(duì)，上海200433)

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)及其導(dǎo)致的截癱是降主動(dòng)脈和胸、腹主動(dòng)脈手術(shù)后的嚴(yán)重并發(fā)癥，發(fā)生率高達(dá)3.8%～16.7%。極大影響了手術(shù)效果，并給患者造成巨大的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。目前，仍缺乏積極有效的預(yù)防措施。

脊髓損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)過程。原發(fā)性損傷是由各種因素導(dǎo)致的脊髓組織的直接損傷，具有即刻性和不可逆性特點(diǎn)。繼發(fā)性損傷則是由原發(fā)損傷導(dǎo)致的一系列生物化學(xué)反應(yīng)，包括水腫、缺血再灌注損傷、炎性反應(yīng)、興奮性毒性以及氧化應(yīng)激損傷等［2-3］。研究表明，自由基大量生成導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷是脊髓繼發(fā)性損傷的重要機(jī)制［2］。針對(duì)這一機(jī)制，利用抗氧化劑防治脊髓損傷的研究和應(yīng)用正在不斷深入開展?？寡趸瘎?，如番茄紅素、17-β 雌二醇、氫氣等均已被證明能有效防治脊髓損傷［4-6］。依達(dá)拉奉(Edaravone，Ed)是安替吡啉的代謝產(chǎn)物，是一種非常強(qiáng)的自由基清除劑，目前已廣泛應(yīng)用于臨床上中風(fēng)患者的治療。研究表明依達(dá)拉奉預(yù)處理可通過有效清除氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化，延遲神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕腦缺血以及腦缺血引起的腦水腫和組織損傷［7］。隨著研究的不斷深入，Ed 預(yù)處理對(duì)腎臟、肝臟、腸、視網(wǎng)膜以及心臟等器官缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)也得到了廣泛的證明［8］。但是Ed 預(yù)處理能否對(duì)脊髓損傷起到保護(hù)作用，仍不清楚，也未見報(bào)道。本研究以離體培養(yǎng)大鼠脊髓神經(jīng)元為研究對(duì)象，觀察Ed 預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)效應(yīng)，為脊髓損傷的防治提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑:雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，孕14 d，購于第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。Neurobasal 培養(yǎng)基和B27 購于Gibco 公司。β-tubulin Ⅲ抗體購于Sigma 公司。蛋白提取試劑盒、BCA 法蛋白定量試劑盒、總超氧化合物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒以及谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒均購于江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，CCK-8 檢測(cè)試劑盒購于日本同仁公司，乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒購于南京建成公司。Ed 購于福建天泉藥業(yè)股份有限公司。番茄紅素(Lycopene，LP)購于新疆瑞德萊福生物科技有限公司。

1.2 脊髓神經(jīng)元培養(yǎng):10%水合氯醛麻醉SD 孕鼠，無菌條件下取出胎鼠，解剖鏡下分離出脊髓，仔細(xì)分離軟脊膜和血管。用D1-SGH 解剖液(D1 為無鈣、鎂離子的Pucks 液，SGH 為蔗糖、葡萄糖和HEPES 的緩沖液)清洗分離的脊髓3 次，虹膜剪將脊髓剪成約1 mm3的組織塊。然后用0.05%胰蛋白酶于37℃培養(yǎng)箱中消化20 min。用含20%胎牛血清的DMEM 終止消化1 min。巴斯德滴管吹打15 次制成單細(xì)胞懸液，靜置10 min后收集中層細(xì)胞懸液，以1×106/ml 的密度均勻接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，4 h 后全量換含2%B27 的Neurobasal 培養(yǎng)基，24 h 后加入阿糖胞苷(5 μmol/L)抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)(作用24 h)，以后每3 天進(jìn)行半量換液。

1.3 脊髓神經(jīng)元鑒定:取培養(yǎng)7 d 的脊髓神經(jīng)元進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。棄培養(yǎng)液，PBS 漂洗2 次后加入4%多聚甲醛，室溫固定30 min，PBS 漂洗5 min×4，加β-tubulin Ⅲ抗體每蓋片50 μl，37℃濕盒孵育1 h 后4℃冰箱過夜，PBS 漂洗5 min×3次，HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 37℃孵育1.5 h，PBS 漂洗5 min×3次，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染細(xì)胞核5 min，漂洗封片后熒光顯微鏡觀察、照相。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)一共分為7 組(n=3)正常對(duì)照組(Con)、H2O2損傷組、GOX 損傷組、Ed+H2O2損傷組、Ed+GOX 損傷組、LP+H2O2損傷組、LP+GOX 損傷組。Ed 和LP 均在損傷前30 min 加入，Ed 終濃度為25、50、100 μM，LP 終濃度為5 μM［9］。

1.5 氧化損傷模型:實(shí)驗(yàn)中采用了H2O2損傷模型和GOX 損傷 模 型:H2O2 損 傷 模 型(200 μl，4 h)，GOX 損 傷 模 型(20 mU/ml，2 h)

1.6 細(xì)胞損傷檢測(cè)

1.6.1 細(xì)胞活性檢測(cè):脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)在96 孔板中，損傷結(jié)束后，PBS 漂洗2 遍，全量換含有CCK-8 檢測(cè)試劑的Neurobasal 培養(yǎng)基(CCK-8 檢測(cè)試劑和培養(yǎng)基的比例為1∶10)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h 后檢測(cè)450 nm 處吸光值。

1.6.2 LDH 含量檢測(cè):脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)在6 孔板中，損傷結(jié)束后收集培養(yǎng)液，然后按照LDH 檢測(cè)試劑盒說明書，測(cè)定培養(yǎng)基中LDH 含量。

1.6.3 MDA 含量檢測(cè):脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)在6 孔板中，損傷結(jié)束后棄培養(yǎng)基，用PBS 漂洗兩遍，然后用細(xì)胞裂解液在冰上裂解10 min，收集細(xì)胞裂解液后按照MDA 檢測(cè)試劑盒說明書，測(cè)定細(xì)胞裂解液中MDA 含量。

1.7 SOD 和GSH-Px 活性檢測(cè):脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)在6 孔板中，將各組細(xì)胞裂解后按說明書測(cè)定總SOD 和GSH-Px 活性。

2 結(jié)果

2.1 脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)和鑒定:A 為脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)7 d 時(shí)光鏡下的照片(×200)，B 為免疫組化鑒定結(jié)果。細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)特異性抗原(β-tubulin Ⅲ)，神經(jīng)細(xì)胞及其突起染色呈棕褐色，細(xì)胞核被4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染染色呈藍(lán)色。在光鏡下隨機(jī)視野中計(jì)數(shù)陽性染色細(xì)胞顯示培養(yǎng)體系中神經(jīng)元細(xì)胞比例在90%以上。見圖1。

圖1 大鼠脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)和鑒定

2.2 不同濃度Ed 對(duì)脊髓神經(jīng)元活性的影響:25、50、100 μM的Ed 對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)元活性并無明顯影響。見圖2。

圖2 不同濃度依達(dá)拉奉對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)元活性的影響

2.3 Ed 預(yù)處理減輕大鼠脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷:H2O2(200 μM，4 h)和GOX(20 mU/ml，2 h)均能明顯誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，包括降低脊髓神經(jīng)元活性、升高神經(jīng)元MDA 含量以及升高培養(yǎng)液中LDH 含量。提前30 min 給予不同濃度Ed(25、50、100 μM)和LP 預(yù)處理能明顯逆轉(zhuǎn)H2O2和GOX 誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷。P ＜0.01 vs.Con 組，#p ＜0.05 vs.H2O2/GOX 組，##和＆P ＜ 0.01 vs.H2O2/GOX 組，$P ＜0.05 vs.LP+H2O2/GOX 組。提前30 min Ed 預(yù)處理可以明顯減輕H2O2和GOX 對(duì)脊髓神經(jīng)元的損傷。見圖3。

圖3 依達(dá)拉奉預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)效應(yīng)

圖4 依達(dá)拉奉預(yù)處理對(duì)大鼠脊髓神經(jīng)元總SOD 和GSH-Px 活性的影響

2.4 Ed 預(yù)處理上調(diào)大鼠脊髓神經(jīng)元SOD 和GSH-Px 活性:H2O2和GOX 均能明顯降低脊髓神經(jīng)元總SOD 和GSH-Px 活性。提前30 min 給予Ed 和LP 預(yù)處理均能顯著升高脊髓神經(jīng)元總SOD 和GSH-Px 活性。*P ＜0.01 vs.Con 組，#和＆P ＜0.01 vs.H2O2/GOX 組，$P ＜0.05 vs.LP+H2O2/GOX 組。見圖4。

3 討論

氧化應(yīng)激是脊髓損傷的重要機(jī)制之一，本研究發(fā)現(xiàn)Ed 預(yù)處理可以明顯減輕H2O2和GOX 誘導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，顯著上調(diào)脊髓神經(jīng)元內(nèi)總SOD 和GSH-Px 的活性。

脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分。脂質(zhì)含量比較高，氧化應(yīng)激損傷在脊髓損傷中起著非常重要的作用。此外，由于神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)能力差，脊髓損傷后，救治困難，常遺留嚴(yán)重的后遺癥［1］。

H2O2是機(jī)體內(nèi)一種重要的活性氧，外源性H2O2極易通過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后的H2O2可以與細(xì)胞內(nèi)的過度金屬發(fā)生Fenton 反應(yīng)，形成高活性的自由基如單態(tài)氧、羥自由基等，進(jìn)一步造成細(xì)胞損傷［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，采用直接給予外源性H2O2和給予GOX 間接增加細(xì)胞內(nèi)H2O2含量方法來建立神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型。在機(jī)體內(nèi)GOX 與過氧化氫酶組成一個(gè)氧化還原酶系統(tǒng)，能夠氧化β-D-葡萄糖生成H2O2和D-葡萄糖酸內(nèi)酯，在這個(gè)過程中葡萄糖氧化酶的特點(diǎn)是能夠消耗氧氣，催化葡萄糖氧化，生成濃度較穩(wěn)定的H2O2［11］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明直接給予外源性H2O2 和給予GOX 均能明顯降低神經(jīng)元活性、顯著增加神經(jīng)元MDA 含量和培養(yǎng)液中LDH 含量，提示在本實(shí)驗(yàn)中這兩種方法均能成功建立神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷模型。

SOD 和GSH-Px 是細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶系統(tǒng)的重要組成部分。SOD 能催化超氧化物陰離子生成H2O2。GSH-Px 可以分解H2O2和過氧化物，清除細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)和有機(jī)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞膜機(jī)構(gòu)和功能完整的作用［12］。MDA 和LDH 是較為常用的細(xì)胞損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)。MDA 是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的嚴(yán)重程度。LDH 在細(xì)胞損傷后釋放到周圍環(huán)境中，能進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞損傷。SOD、GSH-Px、MDA 和LDH 測(cè)定的聯(lián)合應(yīng)用既反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊后損傷的嚴(yán)重程度。

Ed 是一種極強(qiáng)的自由基清除劑，能有效清除細(xì)胞內(nèi)自由基，保護(hù)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。在本研究中選取了25、50、100 μM三個(gè)不同的濃度，研究證實(shí)隨著Ed 劑量的增加，Ed 預(yù)處理對(duì)脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)效應(yīng)逐漸增強(qiáng)即存在劑量效應(yīng)。但是由于本實(shí)驗(yàn)的主要目的是探討Ed 預(yù)處理是否對(duì)脊髓損傷具有保護(hù)效應(yīng)，所以繼續(xù)增加Ed 劑量能否更有效的保護(hù)脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷并為進(jìn)一步探索。LP 是一種開鏈?zhǔn)降牟伙柡皖惡}卜素，具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基的能力，并且已被證明能有效保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷［13］。在本實(shí)驗(yàn)中使用LP 的目的是作為陽性對(duì)照，進(jìn)一步說明LP 對(duì)脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用［14］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LP 50 μM對(duì)脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用與LP 的保護(hù)作用沒有明顯差異，但是依達(dá)拉奉100 μM 對(duì)脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用則明顯強(qiáng)于LP。

本研究以離體培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)Ed 預(yù)處理可通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗氧化物酶活性保護(hù)脊髓神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷［15］。Ed 預(yù)處理作為一種簡(jiǎn)易方便、安全有效的方法在臨床上防治脊髓損傷可能將有較高的應(yīng)用價(jià)值，但對(duì)其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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