黃曉雷， 李元濤， 李 泳， 齊曉非， 文亞杰， 吳銘廣

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院麻醉科，深圳 518028

利多卡因是剖宮產(chǎn)手術(shù)中常用局麻藥［1－2］。臨床濃度的局麻藥可抑制子宮平滑肌收縮并減弱子宮收縮力，進(jìn)而增加產(chǎn)后出血的發(fā)生率［3－5］。而剖宮產(chǎn)后給予催產(chǎn)素促進(jìn)子宮收縮已成為防治術(shù)后子宮出血的常規(guī)手段［6］。那么，利多卡因是否可影響催產(chǎn)素促子宮平滑肌收縮？其導(dǎo)致子宮平滑肌收縮功能減弱的具體機(jī)制是什么？研究表明，子宮平滑肌收縮功能與細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度密切相關(guān)［7－9］。產(chǎn)婦生產(chǎn)過(guò)程中，催產(chǎn)素可通過(guò)激活催產(chǎn)素受體導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高［10－11］。細(xì)胞內(nèi) Ca2＋濃度升高可誘發(fā)鈣調(diào)蛋白相關(guān)肌球蛋白輕鏈激酶激活進(jìn)而導(dǎo)致子宮平滑肌收縮［12］。由此可見(jiàn)，利多卡因所致子宮收縮力減弱可能與催產(chǎn)素及其Ca2＋調(diào)節(jié)功能異常相關(guān)。因此，本研究擬觀察利多卡因?qū)ψ园l(fā)性及催產(chǎn)素誘發(fā)人子宮平滑肌收縮的影響并探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

利多卡因及催產(chǎn)素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Krebs 液 含 有 NaCl 119mmol／L，MgSO41.2 mmol／L，KH2PO41.2mmol／L，NaHCO325mmol／L，CaCl22.5mmol／L，葡萄糖11.5mmol／L，EDTA 0.026mmol／L；鈣離子熒光染料 Fluo-3AM 購(gòu)自美國(guó)Molecular Probe公司；抗磷酸化PKC抗體、抗總PKC抗體、抗催產(chǎn)素受體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；抗β-actin抗體購(gòu)自武漢博士德公司；應(yīng)變式傳感器購(gòu)自日本Kyowa公司，型號(hào)LVS-20GA；共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Zeiss公司，型號(hào)LSM-510。

1.2 子宮平滑肌組織培養(yǎng)

本研究流程經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選擇孕足月（孕周≥38周）擬行剖宮產(chǎn)術(shù)的健康產(chǎn)婦，胎兒及胎盤(pán)取出后于子宮下段切口上緣取條形子宮平滑肌組織，將其置入預(yù)冷無(wú)菌Krebs液中。Krebs液沖洗3遍去除組織表面殘留血液。37℃ Krebs液中仔細(xì)剝離子宮及環(huán)形子宮平滑肌層，僅保留外層縱行子宮平滑肌并將其修剪為寬2mm、長(zhǎng)15mm左右的組織塊。平滑肌組織置入37℃的培養(yǎng)液中，并將組織塊的一段與應(yīng)變式傳感器相連，并給予0.5g的初始張力。

1.3 實(shí)驗(yàn)給藥

初始張力設(shè)置后，一部分平滑?。?0條）給予催產(chǎn)素（10－9mol／L）處理，另一部分（40條）給予等量生理鹽水使其保持自主收縮狀態(tài)。之后，經(jīng)催產(chǎn)素處理或未經(jīng)催產(chǎn)素處理的平滑肌組織被隨機(jī)分為5組（n＝8），包括對(duì)照組及利多卡因（L）1～4組。L1～4組分別給予10－5、5×10－5、10－4、5×10－4mol／L利多卡因，而對(duì)照組僅給予生理鹽水。

1.4 鈣離子濃度檢測(cè)

平滑肌條塊置入含5μmol／L Fluo-3AM 的培養(yǎng)液中室溫孵育3h。Fluo-3AM孵育后，平滑肌組織置入37℃的培養(yǎng)液中，并將組織塊的一段與應(yīng)變式傳感器相連，并給予0.5g的初始張力。組織塊的一段與應(yīng)變式傳感器連接30min后，共聚焦顯微鏡下測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)505nm）。

1.5 蛋白提取及 Western blot檢測(cè)

利多卡因處理1h后，子宮平滑肌用PBS洗3次，加入RIPA裂解液，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集到Eppendorf管中，用BCA試劑盒對(duì)所抽提的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白定量，將蛋白樣品調(diào)整為相同濃度。相同濃度體積的蛋白樣品加入5×樣品緩沖液，100℃沸水中煮8min，12 000g離心8min，之后進(jìn)行SDSPAGE電泳，并經(jīng)電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。PVDF膜在5%的脫脂牛奶中室溫封閉1h。封閉結(jié)束后，PVDF膜浸于5%脫脂牛奶稀釋的相應(yīng)濃度一抗（抗磷酸化PKC抗體，1∶500；抗總PKC抗體，1∶1 000；抗催產(chǎn)素受體抗體，1∶1 000；抗β-actin抗體，1∶500）中在4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。次日將膜取出，TBST液洗滌3次，加入1∶5 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)生物二抗（武漢博士德公司），室溫孵育2h，TBST液洗滌3次，然后進(jìn)行ECL顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio Rad公司）中成像，采用Image Lab 3.0軟件進(jìn)行灰度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。其中，連續(xù)變量的組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 利多卡因?qū)ψ园l(fā)性人子宮平滑肌收縮的影響

與對(duì)照組比較，10－4及5×10－4mol／L利多卡因可導(dǎo)致自發(fā)性收縮子宮平滑肌收縮幅度和收縮頻率減少（P＜0.05或P＜0.01，表1），而10－5及5×10－5mol／L利多卡因?qū)ψ园l(fā)性收縮子宮平滑肌收縮幅度和收縮頻率的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

2.2 利多卡因?qū)Υ弋a(chǎn)素誘發(fā)人子宮平滑肌收縮的影響

與對(duì)照組比較，10－4及5×10－4mol／L利多卡因可導(dǎo)致催產(chǎn)素處理的子宮平滑肌收縮幅度和收縮頻率減少（P＜0.05或P＜0.01，表1），而10－5及5×10－5mol／L利多卡因?qū)Υ弋a(chǎn)素處理的子宮平滑肌收縮幅度和收縮頻率的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

2.3 利多卡因?qū)θ俗訉m平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

與對(duì)照組比較，10－4及5×10－4mol／L利多卡因可導(dǎo)致自發(fā)性收縮子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度減少（P＜0.05或P＜0.01，表2），而10－5及5×10－5mol／L利多卡因?qū)ψ园l(fā)性收縮子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表2）。與對(duì)照組比較，5×10－5、10－4及5×10－4mol／L利多卡因可導(dǎo)致催產(chǎn)素處理的子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度減少（P＜0.05或P＜0.01，表2），而10－5mol／L利多卡因?qū)Υ弋a(chǎn)素處理的子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表1 不同濃度利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌收縮功能的影響（±s，n＝8）Table 1 Effects of lidocaine on the contractions of isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝8）

表1 不同濃度利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌收縮功能的影響（±s，n＝8）Table 1 Effects of lidocaine on the contractions of isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝8）

與對(duì)照組比較，＊P＜0.05＊＊P＜0.01

分組生理鹽水處理幅度（g） 頻率（次／10min）催產(chǎn)素處理幅度（g） 頻率（次／10min）對(duì)照組1.73±0.21 1.37±0.12 2.16±0.30 1.90±0.21 L1 1.64±0.20 1.34±0.12 2.14±0.30 1.88±0.21 L2 1.56±0.19 1.32±0.12 2.06±0.29 1.76±0.19 L3 1.38±0.18＊ 1.19±0.11＊ 1.98±0.20＊ 1.54±0.17＊L4 1.31±0.17＊ 1.06±0.10＊＊ 1.91±0.27＊ 1.33±0.15＊＊

表2 不同濃度利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響（±s，n＝8，nmol／L）Table 2 Effects of lidocaine on the intracellular Ca2＋concentration in isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝8，nmol／L）

表2 不同濃度利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響（±s，n＝8，nmol／L）Table 2 Effects of lidocaine on the intracellular Ca2＋concentration in isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝8，nmol／L）

與對(duì)照組比較，＊P＜0.05＊＊P＜0.01

分組 生理鹽水處理 催產(chǎn)素處理對(duì)照組67.2±5.6 228.5±17.8 L1 63.8±5.1 201.9±18.4 L2 60.6±4.4 191.2±18.1＊L3 57.6±4.6＊ 153.1±12.2＊＊L4 54.7±4.1＊＊ 128.6±9.9＊＊

2.4 利多卡因?qū)θ俗訉m平滑肌催產(chǎn)素受體及磷酸化PKC表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，10－4及5×10－4mol／L利多卡因可導(dǎo)致自發(fā)性收縮和催產(chǎn)素處理的子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化PKC表達(dá)水平降低（P＜0.05或P＜0.01，表3）。但10－4及5×10－4mol／L利多卡因?qū)ψ园l(fā)性收縮和催產(chǎn)素處理的子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)催產(chǎn)素受體的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

3 討論

已有研究表明，局麻藥如利多卡因可導(dǎo)致離體子宮平滑肌自發(fā)性收縮減弱［13－14］。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利多卡因不僅可減弱人子宮平滑肌自發(fā)性收縮，亦可抑制催產(chǎn)素促子宮平滑肌收縮作用；而這種作用可能與平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度減少及PKC磷酸化水平降低相關(guān)。

妊娠期婦女子宮平滑肌具有自發(fā)性收縮活動(dòng)。而體外情況下子宮平滑肌亦可產(chǎn)生類似的自發(fā)性規(guī)律收縮［15］。這種自發(fā)性規(guī)律收縮受到細(xì)胞動(dòng)作電位、平滑肌內(nèi)鈣離子濃度及表面功能受體的調(diào)控［16－17］。利多卡因等局麻藥的主要作用機(jī)制是抑制細(xì)胞膜鈉離子通道介導(dǎo)鈉離子內(nèi)流［18－19］。鈉離子內(nèi)流過(guò)度減少可影響動(dòng)作電位生成和鈣離子內(nèi)流，從而減弱細(xì)胞興奮性［20］。但利多卡因能否影響自發(fā)性及催產(chǎn)素誘發(fā)子宮平滑肌收縮功能仍有待進(jìn)一步探討。

表3 利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌細(xì)胞內(nèi)PKC磷酸化水平及催產(chǎn)素受體表達(dá)水平的影響（±s，n＝5）Table 3 Effects of lidocaine on the levels of PKC phosphorylation and oxytocin receptor protein expression in isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝5）

表3 利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌細(xì)胞內(nèi)PKC磷酸化水平及催產(chǎn)素受體表達(dá)水平的影響（±s，n＝5）Table 3 Effects of lidocaine on the levels of PKC phosphorylation and oxytocin receptor protein expression in isolated myometrial smooth muscles from pregnant women（±s，n＝5）

與對(duì)照組比較，＊P＜0.05＊＊P＜0.01

PKC磷酸化水平（%）分組催產(chǎn)素受體（%）生理鹽水處理 催產(chǎn)素處理對(duì)照組生理鹽水處理 催產(chǎn)素處理90.2±10.8 91.6±8.3 100.0±14.0 157.4±17.3 100.0±12.0 95.0±8.6 L1 97.3±12.5 147.8±14.9 96.2±11.0 92.0±6.6 L2 87.0±13.4 135.4±17.8 96.3±14.0 94.0±7.9 L3 72.4±12.8＊ 124.1±13.9＊ 94.8±11.4 92.9±8.4 L4 64.5±12.4＊ 95.2±11.0＊＊

利多卡因是臨床上常用的局麻藥，在剖宮產(chǎn)手術(shù)硬膜外麻醉中得到廣泛應(yīng)用［21］。研究表明，在常規(guī)使用利多卡因行硬膜外麻醉的剖宮產(chǎn)術(shù)中，血漿中利多卡因的濃度約為10－5～10－4mol／L［22］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予子宮平滑肌10－5、5×10－5、10－4及5×10－4mol／L利多卡因，觀察不同濃度利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌收縮功能的影響。與前期研究結(jié)果一致［13－14］，我們的結(jié)果表明，10－4及5×10－4mol／L的利多卡因可顯著減弱子宮平滑肌自主收縮功能。

催產(chǎn)素是剖宮產(chǎn)手術(shù)中的常規(guī)用藥［23］。臨床上常于胎兒及胎盤(pán)取出后靜脈給予催產(chǎn)素以促進(jìn)子宮收縮，防止術(shù)后子宮出血的發(fā)生。因此，本實(shí)驗(yàn)亦觀察了催產(chǎn)素預(yù)處理狀況下，利多卡因?qū)ψ訉m平滑肌收縮功能的影響。結(jié)果表明，10－4及5×10－4mol／L的利多卡因可顯著減弱催產(chǎn)素誘發(fā)的子宮平滑肌收縮。這就說(shuō)明，利多卡因不僅可導(dǎo)致子宮平滑肌自主收縮功能下降，亦可導(dǎo)致催產(chǎn)素促子宮平滑肌收縮能力減弱。因此，較高劑量的利多卡因可能導(dǎo)致子宮平滑肌對(duì)催產(chǎn)素反應(yīng)性降低進(jìn)而增加剖宮產(chǎn)后產(chǎn)后出血的風(fēng)險(xiǎn)。

利多卡因誘發(fā)子宮平滑肌收縮能力減弱的機(jī)制尚不清楚。研究表明，細(xì)胞鈣離子是調(diào)節(jié)子宮平滑肌收縮的關(guān)鍵分子［24］。催產(chǎn)素可作用于子宮平滑肌表面的催產(chǎn)素受體，通過(guò)激活PKC信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度增加，從而促進(jìn)子宮平滑肌收縮［25］。而子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低可能是導(dǎo)致子宮收縮異常及產(chǎn)后出血的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10－4及5×10－4mol／L的利多卡因可顯著減少自主收縮子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，并減弱催產(chǎn)素誘發(fā)的鈣離子內(nèi)流作用。與此同時(shí)，10－4及5×10－4mol／L的利多卡因亦可導(dǎo)致子宮平滑肌細(xì)胞內(nèi)磷酸化PKC水平下降。PKC活性（磷酸化水平）下降可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜平滑肌內(nèi)肌球蛋白動(dòng)能減弱［25］，從而加重子宮平滑肌收縮異常。

綜上所述，利多卡因可能通過(guò)抑制子宮平滑肌PKC信號(hào)通路，從而降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，最終減弱人子宮平滑肌自發(fā)性收縮并抑制催產(chǎn)素的促收縮作用。

［1］ Farzi F，Mirmansouri A，F(xiàn)orghanparast K，et al.Addition of intrathecal fentanyl or meperidine to lidocaine and epinephrine for spinal anesthesia in elective cesarean delivery［J］.Anesth Pain Med，2014，4（1）：e14081.

［2］ Kessous R，Wiznitzer A，Polachek H，et al.Preoperative analgesia with local lidocaine infiltration for post cesarean delivery pain management［J］.J Matern Fetal Neonatal Med，2012，25（7）：1131-1134.

［3］ Nacitarhan C，Sadan G，Kayacan N，et al.The effects of opioids，local anesthetics and adjuvants on isolated pregnant rat uterine muscles［J］.Methods Find Exp Clin Pharmacol，2007，29（4）：273-276.

［4］ Wei J S，Jin Z B，Yin Z Q，et al.Effects of local anesthetics on contractions of pregnant and non-pregnant rat myometriumin vitro［J］.Acta Physiol Hung，2014，101（2）：228-235.

［5］ Karsli B，Kayacan N，Kucukyavuz Z，et al.Effects of local anesthetics on pregnant uterine muscles［J］.Pol J Pharmacol，2003，55（1）：51-56.

［6］ Kotaska A J，Klein M C，Liston R M.Epidural analgesia associated with low-dose oxytocin augmentation increases cesarean births：a critical look at the external validity of randomized trials［J］.Am J Obstet Gynecol，2006，194（3）：809-814.

［7］ Bernstein K，Vink J Y，F(xiàn)u X W，et al.Calcium-activated chloride channels anoctamin 1and 2promote murine uterine smooth muscle contractility［J］.Am J Obstet Gynecol，2014，211（6）：681-688.

［8］ 黃曉雷，羅儀，李元濤，等.丙泊酚對(duì)人子宮平滑肌細(xì)胞Ca2＋跨膜內(nèi)流和肌漿網(wǎng)鈣釋放功能的影響［J］.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，40（3）：357-360.

［9］ 李德，伍衛(wèi)，駱寧，等.鈣釋放通道穩(wěn)定蛋白過(guò)度表達(dá)對(duì)心力衰竭心室肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)功能的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2007，23（7）：1263-1266.

［10］ Dyer R A，Butwick A J，Carvalho B.Oxytocin for labour and caesarean delivery：implications for the anaesthesiologist［J］.Curr Opin Anaesthesiol，2011，24（3）：255-261.

［11］ Cretoiu S M，Simionescu A A，Caravia L，et al.Complex effects of imatinib on spontaneous and oxytocin-induced contractions in human non-pregnant myometrium［J］.Acta Physiol Hung，2011，98（3）：329-338.

［12］ Wray S.Uterine contraction and physiological mechanisms of modulation［J］.Am J Physiol，1993，264（1Pt 1）：C1-C18.

［13］ Karsli B，Kayacan N，Kucukyavuz Z，et al.Effects of local anesthetics on pregnant uterine muscles［J］.Pol J Pharmacol，2003，55（1）：51-56.

［14］ Nacitarhan C，Sadan G，Kayacan N，et al.The effects of opioids，local anesthetics and adjuvants on isolated pregnant rat uterine muscles［J］.Methods Find Exp Clin Pharmacol，2007，29（4）：273-276.

［15］ Dallot E，Pouchelet M，Gouhier N，et al.Contraction of cultured human uterine smooth muscle cells after stimulation with endothelin-1［J］.Biol Reprod，2003，68（3）：937-942.

［16］ Tong W C，Choi C Y，Kharche S，et al.A computational model of the ionic currents，Ca2＋dynamics and action potentials underlying contraction of isolated uterine smooth muscle［J］.PLoS One，2011，6（4）：e18685.

［17］ Rauk P N，F(xiàn)riebe-Hoffmann U，Winebrenner L D，et al.Interleukin-6up-regulates the oxytocin receptor in cultured uterine smooth muscle cells［J］.Am J Reprod Immunol，2001，45（3）：148-153.

［18］ Mao J，Chen L L.Systemic lidocaine for neuropathic pain relief［J］.Pain，2000，87（1）：7-17.

［19］ Roberson D P，Binshtok A M，Blasl F，et al.Targeting of sodium channel blockers into nociceptors to produce long-duration analgesia：a systematic study and review［J］.Br J Pharmacol，2011，164（1）：48-58.

［20］ Xu F，Garavito-Aguilar Z，Recio-Pinto E，et al.Local anesthetics modulate neuronal calcium signaling through multiple sites of action［J］.Anesthesiology，2003，98（5）：1139-1146.

［21］ El-Tahan M R，Warda O M，Diab D G，et al.A randomized study of the effects of perioperative i.v.lidocaine on hemodynamic and hormonal responses for cesarean section［J］.J Anesth，2009，23（2）：215-221.

［22］ Downing J W，Johnson H V，Gonzalez H F，et al.The pharmacokinetics of epidural lidocaine and bupivacaine during cesarean section［J］.Anesth Analg，1997，84（3）：527-532.

［23］ Balki M，Ronayne M，Davies S，et al.Minimum oxytocin dose requirement after cesarean delivery for labor arrest［J］.Obstet Gynecol，2006，107（1）：45-50.

［24］ Ledoux J，Werner M E，Brayden J E，et al.Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone［J］.Physiology（Bethesda），2006，21（1）：69-78.

［25］ Sanborn B M.Hormones and calcium：mechanisms controlling uterine smooth muscle contractile activity.The Litchfield Lecture［J］.Exp Physiol，2001，86（2）：223-237.