袁向芬，吳紹強，張永寧，林祥梅

（中國檢驗檢疫科學研究院動物檢疫研究所，北京 100029）

2011年秋季，德國北部和荷蘭西部等地一些奶牛場暴發(fā)了一種以發(fā)熱、產奶量下降、腹瀉、嚴重時流產等為臨床癥狀的新型動物疫病。德國弗里德里希洛福勒研究所（Friedrich-Loeffler-Institut，F(xiàn)LI）通過實驗室診斷與研究，確定導致此次疫病的病原體為一種新型布尼亞病毒，并將其命名為施馬倫貝格病毒（Schmallenberg virus，SBV），將其引起的疫病稱為施馬倫貝格病[1]。該病主要感染綿羊、牛、山羊以及鹿等反芻動物，截至2013年10月，其已迅速蔓延至28個國家，引起了世界動物衛(wèi)生組織（OIE）、歐盟和國際社會的高度重視。

鑒于SBV可通過精液等遺傳物質傳播，加之我國與歐盟國家之間的反芻動物遺傳物質貿易頻繁，建立一種敏感、快速、特異及臨床診斷可行的檢測方法尤為迫切，目前，可用于施馬倫貝格病診斷的技術主要包括：病毒分離[2，3]、中和試驗[4]、免疫熒光[5]、ELISA[5]及Real-Time RT-PCR[6]等方法。然而，以上幾種檢測方法或需借助特殊儀器，或需較長周期，對試驗環(huán)境的要求也較為嚴謹，因此并不完全適用于養(yǎng)殖場、野外及口岸的現(xiàn)場檢疫。環(huán)介導等溫擴增技術（loop-medieated isothermal amplif i cation，LAMP）自2000年首次報道以來，因其高效、快速、高特異性等優(yōu)點被廣泛應用于動物疫病的檢測工作[7-10]。該技術依賴于能夠識別靶序列上6個特異性區(qū)域的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在簡單的等溫條件下即可實現(xiàn)靶序列的高效擴增[11，12]，整個過程中對環(huán)境、儀器等條件的要求均極其簡單，特別適用于動物疫病的現(xiàn)場檢疫。本研究針對SBV的S基因節(jié)段建立了其RTLAMP方法，并通過一系列試驗證明該方法與實時熒光RT-PCR方法相比具有良好的敏感性和特異性，同時對于臨床樣品的快速檢測也具有高度適用性。

1 材料和方法

1.1 樣品

SBV陽性RNA樣品由德國FLI實驗室提供，用于提取RNA的病毒培養(yǎng)液濃度為6×107TCID50/mL。由于與SBV同屬、且親緣關系很近[13]的赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）、沙門達病毒（Shamonda virus，SHAV）、艾羅病毒（Aino virus，AINOV）、道格拉斯病毒（Douglas virus，DOUV）Australia 株、道格拉斯病毒（Douglas virus）Texas株和辛波病毒（Simbu virus）多為國外動物疫病，因此特異性試驗所需的相關病毒S基因節(jié)段核酸均由寶生物工程（大連）有限公司全基因合成獲得，合成序列參考表1。

103份牛、羊臨床全血樣品采集自內蒙、天津等地養(yǎng)殖場。

1.2 引物的設計與合成

本研究對比了GenBank中SBV及其同屬各病毒的基因序列，針對SBV的S基因節(jié)段序列，利用Primer Explorer version 4在線引物設計軟件進行引物設計，設計了一套用于LAMP反應的引物（表2），引物交寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 病毒參考序列

表2 引物設計

1.3 RNA提取

陽性RNA樣品由德國FLI實驗室提供，其提取按照Trizol法進行，取1mLSBV病毒培養(yǎng) 液（6×107TCID50/mL） 進 行RNA的 提 取，用30μLDEPC水進行RNA的溶解，經換算可知RNA濃度相當于2×106TCID50/μL。臨床血液樣品RNA的提取，有本實驗室按照Trizol法提取，具體操作參照說明書進行。提取的RNA均置于-80℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-LAMP條件優(yōu)化與方法建立

為實時監(jiān)測不同反應條件下RT-LAMP的進展情況，反應條件的優(yōu)化借助環(huán)介導等溫擴增實時濁度儀LA-320c進行，在Loopamp RNA Amplification Kit（RT-LAMP）試劑盒（Eiken Chemical Co.，Ltd，Tokyo，Japan）基礎上，主要對反應的引物濃度、退火溫度（60-65℃）、反應時間進行優(yōu)化（表3）。

1.5 RT-LAMP方法敏感性及特異性分析

用優(yōu)化后的RT-LAMP檢測方法對SBV同屬的 AKAV、SHAV、AINOV、DOUV Australia株、DOUV Texas株及Simbu病毒的S節(jié)段核酸樣品進行擴增，評估本方法的特異性。設置SBV RNA樣品為陽性對照，滅菌水為陰性對照。另外，按照優(yōu)化后的條件和程序對本方法靈敏度進行評估，采用10倍系列稀釋的SBV RNA樣品（2×106～2×10-1TCID50/μL）進行，來確定本方法的最低檢測限。反應結果可通過肉眼觀察判定：當反應液中加入熒光染料鈣黃綠素（Calcein）時，可根據(jù)反應后溶液的顏色變化進行鑒定，陽性反應溶液會由原來的橙色變?yōu)榱辆G色，陰性仍保持橙色；還可利用電泳分析進行判定：取5μL反應液于2.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，在紫外下觀察電泳條帶并拍照記錄。

表3 溫度和內引物濃度優(yōu)化

1.6 SBV與SHAV的鑒別診斷

SBV和SHAV S基因節(jié)段序列同源性極高，可達97%，因此基于S節(jié)段的常規(guī)核酸擴增技術無法實現(xiàn)兩者的準確鑒別。通過對GenBank中SBV和SHAV的S節(jié)段基因序列進行酶切位點分析發(fā)現(xiàn)，引物F1和F2對應序列之間的靶序列上，SHAV存在一特異性酶切位點Af l II（5'C^TTAAG3'）（表4），而SBV并不存在該位點，因此，可通過對RT-LAMP反應產物進行酶切來進一步鑒別SBV與SHAV。

表4 酶切位點序列分析

1.7 Real-time RT-PCR方法

德國FLI實驗室針對SBV的S基因節(jié)段建立了檢測施馬倫貝格病的熒光定量RT-PCR方法[6]。該方法的商品化試劑盒已由Qiagen公司進行生產與銷售（貨號FLI B585）。參照該試劑盒說明書，對10倍系列稀釋的SBV陽性RNA及制備的其同屬6種病毒S節(jié)段核酸樣品進行擴增，反應結束后，與RT-LAMP檢測方法的靈敏度及特異性進行比較。其反應程序為：45℃ 10min（反轉錄）；95℃ 10min（預變性）；95℃ 15s，56℃ 30，72℃30s，42個循環(huán)（PCR反應），在56℃退火階段進行熒光信號的收集，全程108min。

1.8 臨床樣品的檢測

用建立的RT-LAMP方法檢測103份臨床樣品，并與熒光定量RT-PCR的檢測結果進行比較。

2 結果

2.1 RT-LAMP方法優(yōu)化

經過一系列優(yōu)化，確定了SBV RT-LAMP方法的反應體系（25μL）為：FIP和BIP各40pmol，F(xiàn)3和B3各5pmol，LF和LP各20pmol，2×Reaction Mix 12.5μL（Tris-HCl（pH 8.8）40 mM，KCl 20mM，MgSO416mM，（NH4）2SO420mM，Tween 200.2%，Betaine 1.6 M，dNTPs 2.8mM each），Enzyme Mix 1.0μL，核酸RNA 5μL，另外，反應液中還加入1μL熒光試劑FDR（Eiken Chemical Co.，Ltd，Tokyo，Japan）來監(jiān)測擴增產物。反應程序為：63℃恒溫下擴增50min；80℃酶滅活5min，該程序既可在恒溫水浴鍋中進行，也可在金屬浴及各種核酸擴增儀等儀器中進行。反應后，通過肉眼觀察顏色變化即可判定反應陰陽性。

2.2 RT-LAMP方法的敏感性和特異性

用建立的RT-LAMP方法對10倍系列稀釋的SBV陽性RNA樣品進行擴增，結果如圖所示（圖1A，1B），本方法可成功檢測到2×100TCID50/μL的陽性RNA，染料法與瓊脂糖凝膠電泳法的結果一致，結合加入反應體系的RNA體積，靈敏度可達10TCID50。特異性試驗顯示（圖1D），僅SBV及SHAV發(fā)生擴增，反應管顏色由原來的橙色轉變?yōu)榱辆G色，與電泳結果一致（圖1E），說明該方法與SHAV存在交叉反應。熒光定量RTPCR方法的靈敏度同為10TCID50（圖1C），特異性試驗顯示其可與SHAV、DOUV Australia株和DOUV Texas株發(fā)生交叉反應（圖1F）。相比之下，本研究建立的RT-LAMP方法兼具了良好的敏感性和特異性。

圖1 靈敏度與特異性試驗

2.3 SBV與SHAV的鑒別診斷

圖2 酶切鑒定試驗

25μL酶切反應體系中包含5μL RT-LAMP產物，2.5μL cutsmart buffer，8U Af l II酶（New England Biolabs，USA）。37℃孵育過夜后，取10μL酶切產物于2.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，在紫外顯像儀中觀察酶切后條帶的變化。結果與預期結果相符，SBV與SHAV呈現(xiàn)出不同的酶切結果，如圖2所示，SBV LAMP產物經酶切后，與SBV LAMP產物的電泳條帶一致，未發(fā)生變化，說明未發(fā)生酶切反應；而SHAV則在227bp位置有一明顯新增條帶產生，借此即可實現(xiàn)SBV與SHAV的鑒別性診斷。

2.4 臨床樣品檢測

為評估本研究建立的RT-LAMP方法的臨床適用性，本課題組采集了內蒙、天津等地的103份牛、羊全血樣品，分別用本研究建立的RTLAMP方法及熒光定量RT-PCR方法對樣品進行檢測。結果顯示，兩種方法檢測的陽性率均為0%。說明所采集的103份樣品均為SBV陰性。

3 討論

本研究建立了一種快速檢測SBV的RT-LAMP方法，并利用酶切可鑒別診斷SBV及SHAV。環(huán)引物的應用大大加速了反應速率[14]，可在50分鐘內完成擴增。同時，本方法具有高度的敏感性，可達10TCID50，與熒光定量RTPCR方法的敏感性相同。而特異性試驗顯示，本研究建立的RT-LAMP方法與德國FLI實驗室所建立的qRT-PCR檢測方法[6]相同。本法可與SHAV發(fā)生交叉反應，因為SBV和的SHAV兩者S節(jié)段核酸序列同源性高達97%[15]?；赟節(jié)段的常規(guī)核酸檢測方法極不易對兩者進行區(qū)分，本類方法更適用于田間、養(yǎng)殖場及口岸等大量樣品的初檢。另外，本研究建立了基于Af l II酶切位點的酶切鑒定方法，可實現(xiàn)兩者的鑒別診斷，增加本方法的特異性，為實驗室確診提供了可信的鑒別診斷方法。本方法的另外一個優(yōu)點還在于，相比于熒光RT-PCR要借助昂貴精密的儀器而言，RT-LAMP可利用簡單的恒溫裝置進行擴增，并可通過多種方法進行結果的判定，如通過肉眼判定、染料法以及傳統(tǒng)的電泳法。研究顯示，本方法采用的染料法完全可以滿足常規(guī)檢測的需要[16]，特別適用于大規(guī)模、野外或口岸的臨床樣品檢測。相比之下，RT-LAMP方法兼具了良好的敏感性、特異性、快捷性及便利性，更適于口岸、養(yǎng)殖場等的現(xiàn)場檢疫，為SBV的防控提供技術儲備。

采集內蒙古、天津等地的牛、羊全血樣品103份，統(tǒng)一處理后進行RT-LAMP檢測。其結果與熒光定量RT-PCR方法的結果完全符合，樣品檢測結果均為SBV陰性，與中國境內目前無SBV存在的相關報道相符[17，18]。但考慮到SBV傳播速度快、涉及范圍廣，該結果同時提示我國繼續(xù)加強對SBV的口岸防控，同時制定相關防控政策，防止SBV跨境傳入中國。

然而，LAMP技術也存在不足之處，這些不足也是限制LAMP技術發(fā)展的主要障礙。LAMP方法具有高效的反應速率，單個目的基因可于短時間內迅速擴增至109拷貝數(shù)，此時極易產生氣溶膠，導致環(huán)境污染以及假陽性的出現(xiàn)，為控制該污染，實驗人員在操作過程中應嚴格注意空間、儀器耗材等的分隔使用，同時反應后盡量利用染料法、比濁法等閉管方法進行判定[8，19-20]，防止反應產物的擴散。另外，有研究者通過試驗發(fā)現(xiàn)LAMP反應對培養(yǎng)基及生物物質干擾具有較強抗性，因此對病毒核酸的提取質量要求較低[21]；且目前對于核酸提取技術的研究也有了很大的進展[22-25]，國內外已有公司 推出了一管式核酸提取試劑，在核酸提取時間及操作上提供了很大便利，然而探索一種可與LAMP技術配套的經濟、快速、便捷、成熟的核酸提取技術，仍是LAMP技術發(fā)展及應用的迫切需要。

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