孫 華 ，高 原 ，王生存 ，郁敏燕 ，郭 豐

（1南通大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，江蘇226001；2南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）

在人類輔助生殖技術(shù)中，囊胚移植可以獲得較高的臨床妊娠率，剩余囊胚凍存可以最大限度地提高胚胎利用率。囊胚玻璃化冷凍技術(shù)因胚胎復(fù)蘇成活率高而被廣泛應(yīng)用于輔助生殖治療周期[1-2]。2001年第一例玻璃化冷凍囊胚的試管嬰兒出生[3-4]，已有的研究認(rèn)為玻璃化冷凍復(fù)蘇對(duì)圍生期及新生兒子代發(fā)育無不利影響[2，5]，但玻璃化冷凍試管嬰兒未進(jìn)入育齡期，玻璃化冷凍復(fù)蘇技術(shù)對(duì)子代生殖力的影響報(bào)道很少。應(yīng)用甚廣的玻璃化冷凍技術(shù)是否會(huì)影響下一代的生育能力值得進(jìn)一步研究。本研究對(duì)C57BL/6小鼠的3.5 d囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍復(fù)蘇移植，檢測其雄性仔鼠的精子質(zhì)量，為囊胚玻璃化冷凍子代的生殖安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)C57BL/6雄鼠、雌鼠，ICR雄、雌鼠由南通大學(xué)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2008-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（蘇）2012-0031。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)IVC籠盒內(nèi)，雄鼠單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水。（2）試劑：孕馬血清促性腺激素PMSG（寧波第二激素廠），人絨毛膜促性腺激素hCG（麗珠），蔗糖、DMSO、乙二醇、礦物油、M2（Sigma），G-Mops、G1、HSA（Vitro life），Diff-Quik 試劑盒（珠海貝索生物有限公司）。

1.2 方法 將玻璃化冷凍復(fù)蘇后小鼠囊胚進(jìn)行代孕鼠體內(nèi)移植，成功獲得妊娠產(chǎn)仔，外觀及體重與正常C57BL/6雄鼠無差異。選擇6只子代雄鼠處死采集精子，同時(shí)處死6只同月齡自然受孕出生的C57BL/6雄鼠為對(duì)照，采集精子。若長時(shí)間不合籠交配，雄鼠的精子數(shù)量雖多活力卻差，而交配后1~3 d內(nèi)雄鼠的精子數(shù)量下降。為收集數(shù)量適宜、活率較好的精子進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)選擇雄鼠合籠見栓后3~5 d采集精子。將囊胚玻璃化冷凍組（觀察組）與對(duì)照組進(jìn)行比較，研究囊胚玻璃化冷凍對(duì)精子質(zhì)量的影響。

1.2.1 囊胚獲?。喝?周齡C57BL/6雌鼠，分批促排卵，分別用PMSG腹腔注射10U/只，46~48 h后腹腔注射hCG10U/只，后合籠，雌鼠于見陰栓后72 h脫頸處死，取子宮，沖洗出囊胚。

1.2.2 囊胚玻璃化冷凍復(fù)蘇移植：囊胚于玻璃化冷凍液1中洗滌3 min后，轉(zhuǎn)移入冷凍液 2洗滌，1min內(nèi)裝桿，直接投入液氮內(nèi)保存。復(fù)蘇時(shí)，將胚胎依次放入0.25 mol/L蔗糖 2 min、0.125 mol/L蔗糖3 min和G-mops中5 min，轉(zhuǎn)移至G1滴中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~4 h后，選擇形態(tài)好的囊胚移植入假孕2.5 d ICR雌鼠（與結(jié)扎雄鼠合籠見栓后2.5 d的ICR雌鼠）子宮。

1.2.3 小鼠培養(yǎng)：待妊娠16.5 d后，代孕ICR雌鼠自然分娩。3周后斷奶分籠飼養(yǎng)。

1.2.4 睪丸臟器系數(shù)的檢查：4~5月齡雄鼠合籠見栓后3~5 d處死，處死前稱取小鼠體重，處死后用酒精消毒腹部，剪開腹壁，取睪丸及附睪組織。于解剖顯微鏡下去除脂肪組織，將睪丸和附睪分開。稱取睪丸重量，計(jì)算睪丸臟器系數(shù)，睪丸臟器系數(shù)=睪丸重量/體重。

1.2.5 采集精子：取附睪尾部用M2沖洗干凈，放入盛有0.5mLM2的3037皿中，將附睪尾多處以細(xì)針尖刺破，并稍擠壓使精子游離到培養(yǎng)液中，37℃孵育20min左右，使精子充分游離，去除附睪組織，吹打混勻，制備精子懸液。

1.2.6 雄鼠精子密度、活力檢測：取5μL精子懸液上清，使用Makler計(jì)數(shù)板，于20×顯微鏡下計(jì)數(shù)，每10小格的總數(shù)×106為1mL精子懸液的密度。同時(shí)記錄前向、非前向及不動(dòng)精子數(shù)目。3次取樣計(jì)數(shù)，計(jì)算平均數(shù)為密度，分別計(jì)算精子總活力、前向活力。

1.2.7 小鼠精子畸形率分析：取1小滴精液滴于載玻片上，涂片。用精子染色試劑盒Diff-Quik染色，自然干燥后鏡檢。每只小鼠觀察500個(gè)頭、尾完整的并且不與其他精子重疊的精子，按頭部畸形、頸部畸形、體部畸形、尾部畸形分別記錄畸形精子數(shù)，并計(jì)算每組小鼠的精子畸形率。精子畸形率（%）=畸形精子總數(shù)/檢查精子總數(shù)×100%。畸形精子指數(shù)（teratozoospermia index，TZI）=總?cè)毕蓊愋?缺陷精子數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，組間差異性比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 囊胚玻璃化冷凍對(duì)睪丸發(fā)育的影響 囊胚玻璃化冷凍組睪丸外觀正常，睪丸重（0.198±0.020）g略低于對(duì)照組（0.212±0.023）g，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且兩組的睪丸指數(shù)也非常接近，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 囊胚玻璃化冷凍與對(duì)照雄鼠的體重、睪丸重量和睪丸指數(shù)

2.2 囊胚玻璃化冷凍對(duì)精子密度、活力的影響 采用WHO 2010精液分析方法，分析各組精子功能。囊胚玻璃化冷凍組精子密度為（13.57±3.07）×106/mL，總活力與前向活力分別為50.67%±2.03%和28.87%±2.54%，與對(duì)照組相比各項(xiàng)指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表 2。

表2 囊胚玻璃化冷凍與對(duì)照雄鼠的精子密度、活力及前向活力

2.3 玻璃化冷凍對(duì)精子畸形率的影響 本研究選用男科實(shí)驗(yàn)室常用的Diff-Quik染色法，對(duì)小鼠精子涂片染色后鏡檢，囊胚玻璃化冷凍組精子畸形率為49.67%±1.21%，精子畸形指數(shù)為1.147±0.006與對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。兩組精子畸形類型亦相似，以頭部畸形和頸部畸形居多，見表3，圖 1。

表3 囊胚玻璃化冷與對(duì)照雄鼠的精子畸形率、畸形指數(shù)

圖1 精子正常形態(tài)和常見畸形類型

3 討 論

在人類輔助生殖技術(shù)中，囊胚的培養(yǎng)和移植對(duì)于提高妊娠率、減少多胎妊娠風(fēng)險(xiǎn)具有非常重要意義[2]，玻璃化冷凍因?yàn)椴僮骱唵?、?fù)蘇后成活率高，成為囊胚期胚胎凍存的主要方法而廣泛應(yīng)用于輔助生殖領(lǐng)域[1-2]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，囊胚玻璃化冷凍可用于重要品系的保種，降低飼養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。進(jìn)行玻璃化冷凍時(shí)需將胚胎暴露于高濃度的冷凍保護(hù)劑中，增加了冷凍保護(hù)劑的毒性作用和滲透性休克對(duì)胚胎的影響[6]。初步研究認(rèn)為玻璃化冷凍對(duì)妊娠率及圍產(chǎn)期子代發(fā)育無不利影響[5]，移植玻璃化胚胎并不增加新生兒的早產(chǎn)率及先天性出生缺陷[2-3]。但是，這些研究大都集中在圍生期或新生兒出生缺陷。1998年玻璃化冷凍人類卵裂期胚胎獲得成功[7]，2001年報(bào)道第一例囊胚玻璃化冷凍復(fù)蘇獲得妊娠[3-4]。由于囊胚玻璃化冷凍的試管嬰兒未進(jìn)入育齡期，玻璃化冷凍技術(shù)對(duì)子代生殖力影響的研究報(bào)道很少。應(yīng)用甚廣的玻璃化冷凍技術(shù)是否會(huì)影響下一代的生育能力值得進(jìn)一步研究。精子質(zhì)量分析是評(píng)判男性生育能力的重要指標(biāo)[8]。本文研究了小鼠囊胚玻璃化冷凍對(duì)精子質(zhì)量的影響，目的是為子代的生殖安全性提供參考。

睪丸是精子生成的器官，睪丸參數(shù)反映的是睪丸組織的發(fā)育情況，是反映藥物對(duì)睪丸的影響或損傷的重要指標(biāo)[9]。本研究結(jié)果顯示玻璃化冷凍與正常組的睪丸參數(shù)差距不大，提示囊胚玻璃化冷凍不影響雄鼠的睪丸發(fā)育。

精子的數(shù)量和活力是除生殖系統(tǒng)激素的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)外，影響男性生殖的的首要因素[10]，這些指標(biāo)的任何一項(xiàng)異常都可能導(dǎo)致生育力受損。本實(shí)驗(yàn)選用的是附睪尾部的精子，與雄鼠射精所得的精子成熟度類似，具有研究意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，玻璃化冷凍對(duì)精子的數(shù)量與活力無影響，但小鼠群本來就是一個(gè)大群體，正常小鼠群中精子數(shù)量間也有偏差，本組研究中小鼠精子參數(shù)也有一些波動(dòng)，增大樣本量可進(jìn)一步提高研究結(jié)果的可靠性。

精子畸形率作為重要的生殖指標(biāo)，廣泛用于雄性生殖能力的觀察。本研究中使用了2010年WHO第五版推薦的男科實(shí)驗(yàn)室常用的精子檢查染色方法，結(jié)果更清楚直觀。結(jié)果顯示囊胚玻璃化冷凍小鼠與對(duì)照小鼠的精子畸形率均為50%左右，2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與文獻(xiàn)相比，本文畸形率數(shù)值均偏高。C57BL/6的小鼠精子畸形率在2.36%~23.9%[11-14]，昆明小鼠畸形率在1.44%~25.98%[15-17]，ICR的畸形率較低，為1.58%~2.26%[18]。也有小鼠精子畸形率較高的報(bào)道，2015年Rodriguez等報(bào)道的CD-1的畸形率為41.5%[19]，與本文數(shù)值接近。我們認(rèn)為正常雄鼠精子畸形率數(shù)值差異大的原因，可能是因?yàn)椴煌废怠⒉煌挲g的小鼠精子畸形率不同，也可能與所采用的精子染色方法有關(guān)?；沃笖?shù)是反映體內(nèi)生育力的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)中囊胚玻璃化冷凍組與對(duì)照組無明顯差異。

綜上，本研究初步認(rèn)為囊胚玻璃化冷凍對(duì)雄仔鼠的精子質(zhì)量無不良影響。然而全面評(píng)估囊胚玻璃化冷凍的子代的生殖安全性，需要更大樣本和更詳細(xì)的檢測。

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