池 君，宋武戰(zhàn)，范泉水，張學(xué)淵，劉 丹，游建軍

研究表明，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中存在著微量的神經(jīng)生長因子（nerve growth factor,NGF），其細(xì)胞中亦分布著NGF的高效受體TrkA[1-2]，NGF要通過與其受體TrkA結(jié)合，啟動細(xì)胞內(nèi)的信號途徑而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)元存活等作用。由于耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（spiral ganglion neurons，SGNs）在聽覺損傷和恢復(fù)中發(fā)揮重要作用，如何利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高細(xì)胞中NGF含量，使SGNs能在耳蝸內(nèi)長期存活，將為感音神經(jīng)性耳聾的基因治療提供新的途徑。本實驗將外源性NGF通過腺病毒導(dǎo)入SGNs中，觀察轉(zhuǎn)染后SGNs的變化和存活時間。

1 材料與方法

1.1 動物及材料 選用出生后3 d健康的SD大鼠10只（20耳）（購自昆明醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證號SYXK2005-0004），雌雄不限。隨機分成兩組，每組5只（10耳）。A組為NGF重組腺病毒轉(zhuǎn)染組，B組為非轉(zhuǎn)染組。攜帶有小鼠NGF基因的重組腺病毒制備參考文獻(xiàn)[3]。

1.2 腺病毒轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[4]。A組中，當(dāng)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)至第 時，將 孔板中原有的培養(yǎng)液吸出一半，加入500 μl腺病毒液；37℃5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，再加入新的細(xì)胞培養(yǎng)液；48 h后半量換液；B組不加入病毒液，培養(yǎng)同前。每天觀察細(xì)胞形態(tài)和熒光變化，兩組細(xì)胞均培養(yǎng)14 d。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測轉(zhuǎn)染前后SGNs中NGF的變化 終止培養(yǎng)后，A、B兩組分別行蛋白質(zhì)免疫印跡檢測。按常規(guī)制備10%的SDS-PAGE凝膠，上樣后電泳，5%積層膠中電壓為80 V，樣品進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至120 V；電泳完畢后，將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（NC）上。麗春紅染色觀察是否有蛋白質(zhì)條帶，然后進(jìn)行下一步操作。封閉1 h，孵育兔抗鼠多克隆抗體NGF（一抗）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），稀釋倍數(shù)1∶500，4℃過夜；TBST液漂洗3次，15 min/次，浸入含HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG （北京中山生物技術(shù)有限公司，1∶1000）的二抗中，37℃ 1 h，TBST液漂洗3次，15 min/次， 化學(xué)發(fā)光法顯影，X膠片記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 B組離體培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 在分離培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中，種植后24 h，可見6孔板底部有細(xì)胞貼壁，此時細(xì)胞突起短，隨著培養(yǎng)時間的延長，突起逐漸長出。培養(yǎng)第5 d，可見SGNs胞體多呈橢圓形，胞體周圍呈現(xiàn)一圈光暈，胞體邊緣光滑，細(xì)胞透明，胞漿均質(zhì)，折光性好。細(xì)胞突起細(xì)長，突起的長度一半大于胞體直徑的2～3倍，可見軸漿多處局部膨起，少數(shù)細(xì)胞的突起相互交織（圖1）。培養(yǎng)第10 d，部分細(xì)胞突起消失，胞體呈不規(guī)則形，貼壁差，少數(shù)細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中（圖2）。培養(yǎng)至第14 d時，多數(shù)細(xì)胞漂浮，細(xì)胞崩解死亡。

2.2 A組離體培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 培養(yǎng)開始至加入腺病毒前，SGNs的形態(tài)同B組。重組腺病毒轉(zhuǎn)染SGNs后第2 d（即培養(yǎng)5 d），倒置顯微鏡下可見SGNs貼壁良好，熒光顯微鏡下可見部分細(xì)胞胞體和突起發(fā)出熒光，強度較弱（圖3）；第5 d（即培養(yǎng)8 d），約有80%～90%的細(xì)胞發(fā)出熒光，強度增強，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，貼壁良好，許多細(xì)胞的突起交織成網(wǎng)（圖 4）。 第 11 d（即培養(yǎng) 14 d），約 50%細(xì)胞仍有熒光發(fā)出，半數(shù)細(xì)胞貼壁良好（圖5）。分別對離體培養(yǎng)10 d的兩組SGNs計數(shù)，B組細(xì)胞較A組顯著減少（P ＜ 0.05）。

圖1 離體培養(yǎng)5 d的SGNs（×100）

圖2 離體培養(yǎng)10 d的SGNs（×100）

圖3 重組腺病毒轉(zhuǎn)染第2 d綠色熒光蛋白在SGNs中的表達(dá)（×100）

圖4 重組腺病毒轉(zhuǎn)染第5 d綠色熒光蛋白在SGNs中的表達(dá)（×200）

圖5 重組腺病毒轉(zhuǎn)染第11 d綠色熒光蛋白在SGNs中的表達(dá)（× 200）

2.3 兩組NGF在SGNs中的表達(dá) 重組腺病毒轉(zhuǎn)染A組后，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法分別檢測兩組的NGF含量，結(jié)果A組的NGF總蛋白灰度值的均數(shù)為 0.718 24±0.036 92，顯著高于 B 組的 0.243 58±0.007 58（P ＜ 0.01，圖 6），提示轉(zhuǎn)染后 A 組螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中NGF的含量高。

圖6 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測NGF在SGNs中的表達(dá)左側(cè)B組；右側(cè)A組

3 討論

迄今已有多種體系的真核表達(dá)載體，生物載體以缺陷型病毒表達(dá)載體為主，利用病毒對動物細(xì)胞的天然感染力，將目的基因表達(dá)單位成功導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)。螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞屬終末分化的神經(jīng)元細(xì)胞，腺病毒是一種雙鏈、無包膜DNA病毒，宿主范圍廣，可感染人體多種組織細(xì)胞，包括分裂期和非分裂期細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞），在基因治療的研究中，其轉(zhuǎn)染效率和安全性日益提高和完善[5-6]。本實驗發(fā)現(xiàn)，腺病毒轉(zhuǎn)染SGNs后第2 d，部分細(xì)胞胞體和突起發(fā)出熒光，提示腺病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并開始表達(dá)目的基因。轉(zhuǎn)染第5 d，多數(shù)細(xì)胞感染病毒并發(fā)出較強熒光。轉(zhuǎn)染第11 d，部分細(xì)胞熒光轉(zhuǎn)弱甚至消失，顯微鏡下示細(xì)胞突起變短、崩解，漂浮，不貼壁。表明腺病毒能順利進(jìn)入生長良好的SGNs細(xì)胞并在其中表達(dá)目的基因，表達(dá)時間約14 d左右，這為外源基因干預(yù)離體SGNs細(xì)胞的途徑提供了一定的實驗基礎(chǔ)。

神經(jīng)生長因子是一種高效多能的神經(jīng)營養(yǎng)因子，廣泛存在于動物體內(nèi)，由 種亞基 按α2βγ2的排列組成，其中只有β亞基具有生物學(xué)作用。在神經(jīng)元發(fā)育成熟期，具有維持感覺神經(jīng)元和中樞神經(jīng)元群的功能、促進(jìn)成熟神經(jīng)元軸索分支等作用。研究表明，NGF對神經(jīng)嵴起源的耳蝸-橄欖束具有誘向和營養(yǎng)作用。Lefebvre等[7]觀察到，外源性NGF能促進(jìn)離體培養(yǎng)的SGNs軸突延長。Staecker等[8]認(rèn)為，NGF及其受體不僅影響出生后耳蝸神經(jīng)元的凋亡和神經(jīng)支配的分布，而且對于防護(hù)受損神經(jīng)元的變性具有一定的潛能。本實驗中，在培養(yǎng)第72 h通過腺病毒將NGF導(dǎo)入SGNs，觀察到轉(zhuǎn)染第2 d（即培養(yǎng)第5 d）綠色熒光蛋白即在某些細(xì)胞中表達(dá)，發(fā)出熒光的神經(jīng)元貼壁良好，軸突長，細(xì)胞的形態(tài)與非轉(zhuǎn)染組比較沒有明顯差別。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，發(fā)出熒光的細(xì)胞數(shù)不斷增多，熒光表達(dá)也逐漸增強，同對照組相比，神經(jīng)元的胞體較大，軸突明顯延長，許多細(xì)胞的軸突相互交織成網(wǎng)，提示導(dǎo)入SGNs中的NGF刺激了胞體和突起的生長。

Kromer[9]切斷SD大鼠雙側(cè)腦中隔到背部海馬的所有膽堿能神經(jīng)纖維，制成腦損傷模型，然后向腦內(nèi)注入NGF或細(xì)胞色素C，2 w后測定神經(jīng)元存活率，結(jié)果細(xì)胞色素C組僅18%，而NGF組為84%，比對照組升高3.5倍，故認(rèn)為在各種中樞神經(jīng)損傷后應(yīng)用外源性NGF可維持神經(jīng)元生存。本實驗觀察了在正常培養(yǎng)條件下NGF對SGNs生存時間的影響，結(jié)果培養(yǎng)第11 d，SGNs細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)正常；培養(yǎng)第14 d，轉(zhuǎn)染組仍有50%SGNs發(fā)出熒光，細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞的形態(tài)沒有明顯改變，交織成網(wǎng)的突起也沒有回縮。而非轉(zhuǎn)染組中培養(yǎng)的SGNs在培養(yǎng)第10 d時即有部分細(xì)胞突起消失，胞體變形甚至死亡；培養(yǎng)第14 d時大多數(shù)細(xì)胞胞體已經(jīng)變形，突起縮短甚至消失，多數(shù)細(xì)胞胞體內(nèi)出現(xiàn)空泡，胞體崩解。從培養(yǎng)存活的時間上，可以初步推測NGF對離體培養(yǎng)的SGNs存活具有促進(jìn)作用。

本實驗將攜帶有NGF基因的腺病毒轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，病毒成功進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)目的基因，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞存活時間延長，為離體SGNs的保護(hù)研究提供了一條可行的途徑。

[1]池君，張學(xué)淵，宋武戰(zhàn).豚鼠耳蝸不同發(fā)育階段神經(jīng)生長因子的分布及其意義[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2007,42（5）:386-387.

[2]CF Dai,PS Steyger,ZM Wang,et al.Expression of Trk A receptors in the mammalian inner ear[J].Hear Res,2004,187（1）:1-11.

[3]池君，張學(xué)淵，宋武戰(zhàn).小鼠神經(jīng)生長因子基因重組腺病毒的構(gòu)建及其在基底膜上的表達(dá) [J].中華耳科學(xué)雜志,2007,5（2）:207-211.

[4]池君,宋武戰(zhàn)，范泉水,等.耳螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)及重組腺病毒在細(xì)胞中的表達(dá)[J].西南國防醫(yī)藥,2013,23（4）:349-351.

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