楊建珍，朱紅英

（新干縣畜牧獸醫(yī)局,江西 吉安 331300）

大腸埃希菌(E．coli)是家禽最常見的病原菌之一。雞大腸桿菌病是由致病性埃希氏大腸桿菌所致的一種雞的常見多發(fā)病，有原發(fā)性的，也有并發(fā)或繼發(fā)性的。發(fā)病率及死亡率高。該病目前已成為危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的重要細(xì)菌性傳染病之一[1]。該病的流行無明顯季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，尤以冬末春初易發(fā)。主要危害幼雞和肉雞。病型復(fù)雜，臨床上主要所致疾病有：大腸桿菌性敗血癥、大腸桿菌性肉芽腫、氣囊炎、滑膜炎、肝周炎、頭腫綜合癥、腹膜炎、輸卵管炎、全眼球炎及臍炎[2]。雞大腸桿菌病的發(fā)生具有一定的條件性，病原可能是外來的致病型大腸桿菌，也可能是體內(nèi)正常情況下存在的大腸桿菌，當(dāng)環(huán)境因素改變或發(fā)生應(yīng)激因素引起發(fā)病[3]。病雞和帶菌雞的糞便、呼吸道勃液及蛋內(nèi)和蛋殼表面帶有大量的致病性大腸桿菌，常造成禽舍環(huán)境、用具、飼料、飲水等的嚴(yán)重污染，成為本病傳播的主要原因[4]。近年來，隨著養(yǎng)雞業(yè)的集約化發(fā)展，雞大腸桿菌病不斷蔓延，其波及的雞種、發(fā)病率及嚴(yán)重程度呈不斷增長趨勢，已居雞細(xì)菌性疾病之首，給養(yǎng)雞戶造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重危害了養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展[5]。

新干縣一規(guī)模化雞場的5～7周齡雞突然發(fā)病，發(fā)病率為100%，病死率為60%左右。主要癥狀為劇烈腹瀉，精神沉郁，眼瞼腫脹，有的雞迅速死亡。通過對死雞肝臟和活雞肝臟中病原菌的分離及生化鑒定，為該雞場的病情診斷提供了依據(jù)，最后通過藥敏試驗初步得出其敏感藥物，為疾病的臨床治療提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料。無菌條件下取新干縣某規(guī)模雞場送檢的病死雞和病雞肝臟。

1.1.2 染色液。革蘭氏碘液、草酸銨結(jié)晶紫、95%酒精、沙黃水溶液、生理鹽水。

1.1.3 藥敏紙片?？敲顾?、壯觀霉素、紅霉素、阿奇霉素、青霉素、硫酸新霉素、泰樂菌素、桿菌肽、甲氧芐啶、安來霉素。以上藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司或自制。

1.1.4 生化試劑。腸桿菌科生化鑒定試劑盒購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.5 普通瓊脂培養(yǎng)基。胰蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉10g、瓊脂2%。

1.1.6 其它器材。37℃生化培養(yǎng)箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器、普通顯微鏡、電子天平、電爐、超凈臺。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 病料的采集。無菌采集病死雞和病雞肝臟，并標(biāo)記為病料A和病料B。迅速置于4℃冰箱保存。

1.2.2 細(xì)菌分離。無菌條件下取病料A和B分別用接種環(huán)接種到普通瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h。觀察細(xì)菌生長和菌落特征。

1.2.3細(xì)菌純化及增菌。分別取初步分離的A菌株和B菌株的單菌落劃線接種于新的普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后挑選典型菌落接種于普通肉湯中，置搖床中以220rpm/min震蕩培養(yǎng)9h，得到A菌株和B菌株的純培養(yǎng)物。

1.2.4 革蘭氏染色。按照常規(guī)方法涂片進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢[6]。

1.2.5 生化試驗。用接種環(huán)分別把A菌株和B菌株的純培養(yǎng)物接種于葡萄糖、乳糖、蛋白胨水等微量發(fā)酵管中，并置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h，觀察微量發(fā)酵管顏色變化。

1.2.6 藥物敏感試驗。采用圓紙片擴(kuò)散試驗。具體操作：用滅菌棉簽從普通肉湯中蘸取A菌株和B菌株的純培養(yǎng)物致密涂布于普通瓊脂平板表面，可重復(fù)來回涂布，用無菌鑷子將各種抗菌藥物圓紙片，分別貼于培養(yǎng)基表面，各片距離要相等，37℃培養(yǎng)24h觀察并記錄結(jié)果[6~7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性

在普通培養(yǎng)基上生長良好，37℃培養(yǎng)24h后長出菌落，直徑為1～3mm，圓形、凸起、光滑、濕潤、半透明、灰白色、邊緣整齊。

2.2 分離菌形態(tài)及特征

該菌經(jīng)革蘭氏染色呈陰性，兩端鈍圓的短桿菌，多呈單個或成雙存在，不形成芽胞，能運動。大小一般為 0.4～0.7μm。

在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～9h后，呈均勻渾濁，管底有少許粘液狀沉淀，液面與管壁可形成菌膜?？芍摼谄胀ㄈ鉁屑纯缮L良好。

2.3 生化試驗結(jié)果

本菌生化反應(yīng)活躍，能分解葡萄糖、乳糖、衛(wèi)茅醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解尿素，不產(chǎn)生硫化氫，不能利用枸櫞酸鹽，靛基質(zhì)試驗呈陰性，氨基酸脫羧酶試驗呈陽性。苯丙氨酸脫氨酶試驗呈陰性（表1、表2）。

表1 A菌株生化試驗結(jié)果

表2 B菌株生化試驗結(jié)果

2.4 藥敏試驗結(jié)果

表4 B菌株藥敏試驗結(jié)果mm

表3 A菌株藥敏試驗結(jié)果mm

分離的2株雞致病性大腸桿菌的藥敏試驗結(jié)果表明：A、B兩菌株都僅對阿奇霉素高度敏感，對壯觀霉素、青霉素中度敏感，對卡那霉素、紅霉素、甲氧芐啶等低度敏感或不敏感（表3、表4）。

3 討論

鑒于雞群發(fā)病后表現(xiàn)的癥狀如病雞精神沉郁，縮頭閉眼，腹部膨滿羽毛逆立，廢食，劇烈腹瀉，排黃綠色稀糞等，與大腸桿菌病極為相似，故直接用普通瓊脂培養(yǎng)基平板劃線分離培養(yǎng)，根據(jù)分離菌菌落的特征，并經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，A、B兩菌株的特性相同，均符合大腸桿菌的特性，表明為同一病原菌。初步認(rèn)定為大腸桿菌。由生化鑒定結(jié)果可知：該菌可發(fā)酵葡萄糖、乳糖及衛(wèi)矛醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不產(chǎn)硫化氫，不分解尿素；靛基質(zhì)試驗呈陰性；苯丙氨酸脫氨酶試驗及枸櫞酸鹽利用實驗均為陰性。這些生化特征進(jìn)一步證實本次分離菌為大腸桿菌。由表3可知該菌僅對阿奇霉素高度敏感，對青霉素和壯觀霉素中度敏感，對其他所用抗生素不敏感或低度敏感，這也正體現(xiàn)了大腸桿菌的耐藥性強(qiáng)、耐藥譜廣的特點。

多年來，對付大腸桿菌的主要措施是應(yīng)用抗生素，其副作用是致使大腸桿菌病的耐藥菌株越來越多，耐藥譜也越來越廣[9]。一些雞場為了控制大腸桿菌和其他細(xì)菌感染，在飼料中添加或在治療過程中盲目使用抗生素也是造成大腸桿菌耐藥性嚴(yán)重的重要原因。據(jù)有關(guān)報道，目前大腸桿菌對包括慶大霉素、強(qiáng)力霉素、氯霉素、青霉素、氟哌酸等藥物都不同程度地產(chǎn)生了耐藥性[10]。由于不同菌株對藥物的敏感性存在差異，建議在使用藥物治療病原菌時要加強(qiáng)對病原菌耐藥性的檢測。因此對病菌進(jìn)行藥敏試驗，篩選出對病原菌敏感的藥物，指導(dǎo)臨床合理用藥，可有效減緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[11]。

大腸桿菌耐藥性菌株越來越多，耐藥性越來越強(qiáng)，給預(yù)防和治療帶來了較大的困難。建議從飼養(yǎng)管理著手搞好環(huán)境衛(wèi)生，對禽舍及用具經(jīng)常消毒，注意育雛期保溫及飼養(yǎng)密度，飼料應(yīng)無糞便污染，營養(yǎng)要全面[12]。

[1]史喜菊,鄭明學(xué),馮柴.雞大腸桿菌病最新研究進(jìn)展[J].畜禽業(yè),2000（8）：14～15.

[2]劉遠(yuǎn)見,蔡海建.病雞及病死雞大腸桿菌的分離鑒定[J]，山東畜牧獸醫(yī)，2009（2）：24～25.

[3]王鐵良.遼寧省雞大腸桿菌分離、鑒定及藥物敏感性試驗[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2009（7）：64～65.

[4]侯勝,劉德全.雞大腸桿菌病的病因及防控措施[J].養(yǎng)殖技術(shù)顧問,2010（1）：126～127.

[5]陸宗允,朱永仁.雞大腸桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2009（4）：44～45.

[6]姚火春主編.獸醫(yī)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)[M].第二版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001,20～45.

[7]陳杖榴主編.獸醫(yī)藥理學(xué)[M].第二版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001,211～221.

[8]陸承平主編.獸醫(yī)微生物學(xué)[M].第二版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001，215～223.

[9]刁有祥，李久芹，陳慶普.山東省雞大腸桿菌的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2002(1)：21～23.

[10]白同臣,曲海波，吳金，等.雞大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007(9)：78～79.

[11]曾麟.大腸桿菌耐藥性的測定 [J].江西畜牧獸醫(yī)雜志，2010(1)：12～13.

[12]楊明凡，李曉峰，陳紅英，等.雞大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(11):78～79.