尹 偉，陶阿麗，戴 一，施伶俐，張國(guó)升

（安徽新華學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 合肥 230088）

多糖作為天然生物體大分子物質(zhì)，具有多種多樣的生物活性，如增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抗氧化作用，并在抗腫瘤方面發(fā)揮著重要的生物活性作用.據(jù)報(bào)道[1]，植物多糖的免疫調(diào)節(jié)作用可能是通過激活機(jī)體免疫細(xì)胞活性，以促進(jìn)這些細(xì)胞對(duì)IL-2、IFN-γ、TNF-α 等細(xì)胞因子的分泌，從而產(chǎn)生一定的免疫調(diào)節(jié)作用.亦有報(bào)道表明[2]，植物多糖的這些免疫作用可能與抗腫瘤作用密切相關(guān).目前報(bào)道較多的植物多糖，如半夏多糖、青蒿多糖等均具有調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫功能以及抑制腫瘤細(xì)胞作用[3].

桂花(Osmanthus fragrans Lour.)，為木犀科木犀屬植物，是木犀科常綠灌木或小喬木.《本草綱目》記載：桂花，味甘、辛，性溫，能暖胃、益胃、驅(qū)寒，并具有疏肝理氣、祛痰止咳和順肺開胃的功效[4].現(xiàn)代研究表明[5]，桂花具有降血糖、抗炎、抑菌、體內(nèi)外抗氧化和清除自由基等生物活性.桂花多糖是桂花的重要成分之一，但是目前對(duì)桂花的研究主要集中在桂花精油方面，而對(duì)桂花多糖的免疫活性則尚未見報(bào)道.

本課題在前期研究的基礎(chǔ)之上，擬使用前期得到的桂花多糖作為原料，考察桂花多糖的體外免疫活性，旨在為臨床新藥研發(fā)提供一定的參考.具體報(bào)道如下：

1 材料

1.1 主要試劑

二甲基亞砜(DMSO，上海市欣誠試劑有限公司)；RPMI-1640(上海元龍生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(江蘇澤雨生物科技有限公司)；刀豆蛋白A(ConA，上海豐壽生物科技有限公司)；MTT(噻唑藍(lán)，上海豐壽生物科技有限公司)；臺(tái)盼藍(lán)(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)

1.2 主要儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海百典儀器廠)；HZS-H水浴振蕩器(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)；

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(上海研拓生物科技有限公司)；550型酶標(biāo)儀(無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司)

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-002號(hào).

2 方法

2.1 制備鼠脾淋巴細(xì)胞

取SPF級(jí)昆明種小鼠，處死(頸椎脫臼方法)，乙醇(75%)中浸泡(5min)，無菌手術(shù)將其脾臟取出，使用PBS洗3次.用消毒無菌鑷子輕輕捻碎脾臟，過篩(200目)，最終得到細(xì)胞懸液，離心，加入0.85%NH4Cl裂解紅細(xì)胞，沖打，靜置約10min，離心，收集細(xì)胞，沖洗，檢測(cè)細(xì)胞存活率(臺(tái)盼藍(lán)方法)>96%.用RPMI-1640(RoswellParkMemorialInstitute)培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)板中(96孔)，于培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中培養(yǎng).

2.2 測(cè)定細(xì)胞濃度和存活率(臺(tái)盼藍(lán)法)

將細(xì)胞懸浮液(100ul)與0.2%(100ul)的臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻，加入500mlNaCl(0.9%)，鏡檢.其中，細(xì)胞數(shù)(每毫升)=大個(gè)中平均或細(xì)胞的數(shù)目×104/ml×稀釋倍數(shù)；細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%，細(xì)胞存活率應(yīng)>90%.

2.3 桂花多糖的毒性試驗(yàn)(脾淋巴細(xì)胞)

將小鼠脾細(xì)胞懸液加至細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)，100ul/孔；加樣品，100ul/孔；相關(guān)陰性對(duì)照組中只加培養(yǎng)基(RPMI-1640).平行三復(fù)孔.放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)48h.取出細(xì)胞板，加MTT(噻唑藍(lán))，20ul/孔，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5h.取出，離心(2500r/min，5min)，去除上清液，每孔加DMSO 100ul，同時(shí)震蕩5min.用酶標(biāo)儀測(cè)定(OD570nm).

2.4 桂花多糖誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定

將小鼠脾細(xì)胞懸液加至細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)，100ul/孔；加樣品，100ul/孔；分別設(shè)置陽性和陰性對(duì)照，其中，ConA濃度為10ug/ml.平行三復(fù)孔.放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)72h.

取出細(xì)胞板，加MTT(噻唑藍(lán))，20ul/孔，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5h.取出，離心(2500r/min，5min)，去除上清液，每孔加DMSO 100ul，同時(shí)震蕩5min.用酶標(biāo)儀測(cè)定(OD570nm).

2.5 ConA誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定

將小鼠脾細(xì)胞懸液加至細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)，150ul/孔；在空白組中加25ulPRMI-1640培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組加ConA 25ul，相關(guān)試驗(yàn)組加ConA溶液分別為25ul，且濃度相同，再加樣品溶液25ul，最終用培養(yǎng)基將體積補(bǔ)充至200ul.檢測(cè)方法同上.

2.6 桂花多糖與ConA聯(lián)合誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定

將小鼠脾細(xì)胞懸液加至細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)，100ul/孔；隨后加入樣品與Con A，50ul/孔，濃度為5ug/ml.同時(shí)設(shè)置陰性、陽性與空白對(duì)照組.檢測(cè)方法同上.

2.7 桂花多糖對(duì)Con A誘導(dǎo)IL-2、IFN-γ 及TNF-α 分泌的作用

2.7.1 桂花多糖聯(lián)合ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ 的細(xì)胞培養(yǎng)液上清的制備

將小鼠脾細(xì)胞懸液加至細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)，100ul/孔；加樣品、ConA，100ul/孔，其中，ConA濃度為5ug/ml.同時(shí)設(shè)置陰性、陽性與空白對(duì)照組.平行三復(fù)孔.放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)48h.取出，合并培養(yǎng)液，離心(2500rpm，5min)，過濾沉淀，上清液備用(-20℃保存).

2.7.2 桂花多糖聯(lián)合Con A誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α 的細(xì)胞培養(yǎng)液上清的制備

將巨噬細(xì)胞懸液加至細(xì)胞培養(yǎng)板(96孔)，1ml/孔，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)2h，并去除上清液，洗去非黏附細(xì)胞(Hank’s溶液)；加樣品、Con A，50ul/孔，其中，ConA濃度為5ug/ml.同時(shí)設(shè)置陰性、陽性與空白對(duì)照組.平行三復(fù)孔.放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)48h.取出，合并培養(yǎng)液，離心(2500rpm，5min)，過濾沉淀，上清液備用(-20℃保存).

2.7.3 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-2、IFN-γ 及TNF-α的測(cè)定

根據(jù)ELISA試劑盒程序測(cè)定OD492值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出IL-2、IFN-γ 及TNF-α 的濃度.

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有研究數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，并采用t檢驗(yàn).

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 桂花多糖的細(xì)胞毒性作用

研究結(jié)果顯示，桂花多糖1μg/ml、10μg/ml及100μg/ml的OD570nm值分別為 (0.264±0.04)、(0.341±0.01)、(0.502±0.02)，顯著優(yōu)于陰性對(duì)照組的數(shù)值(0.113±0.02)，表明桂花多糖對(duì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增值，效果明顯，無顯著細(xì)胞毒性.

表1 桂花多糖以及聯(lián)合誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

表1 桂花多糖以及聯(lián)合誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

試驗(yàn)組樣品單一誘導(dǎo) 聯(lián)合誘導(dǎo)陰性對(duì)照組 0.126±0.01 0.109±0.01 ConA對(duì)照組 0.315±0.03 0.302±0.01 1 0.298±0.01 0.333±0.02桂花多糖(ug/ml)10 0.366±0.03 0.373±0.03 100 0.440±0.02 0.444±0.03 1 0.281±0.01 0.286±0.02香菇多糖(ug/ml)10 0.356±0.02 0.348±0.03 100 0.418±0.03 0.397±0.04

3.2 桂花多糖及桂花多糖聯(lián)合誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖測(cè)定

通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)可得出，桂花多糖試驗(yàn)組的OD570nm數(shù)值均大于對(duì)照組，提示桂花多糖對(duì)鼠脾淋巴細(xì)胞有較好的增殖作用，同時(shí)依據(jù)劑量的加大(1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)，誘導(dǎo)作用亦逐漸加強(qiáng).另，桂花多糖與香菇多糖OD570nm值較為接近，顯示了桂花多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用方面，與香菇多糖效果相當(dāng)，同時(shí)均大于ConA的作用效果.詳見表1.

3.3 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-2、IFN-γ 及TNF-α的測(cè)定

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

IL-2含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線：

y=1.4421x-1.9934(r=0.9992)；

IFN-γ 含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線：

y=1.6001x-1.5329(r=0.9939)；

TNF-α 含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線：

y=1.6044x-1.7171(r=0.9992)；

3.3.2 桂花多糖對(duì)ConA誘導(dǎo)的IL-2、IFN-γ 及TNF-α 指標(biāo)分泌的影響對(duì)比

通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出，桂花多糖實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞因子濃度顯著優(yōu)于對(duì)照組，顯示了桂花多糖對(duì)Con A誘導(dǎo)的細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)分泌促進(jìn)效果顯著，同時(shí)與劑量大小在一定范圍內(nèi)，保持一定的正相關(guān).且同香菇多糖對(duì)細(xì)胞因子分泌的促進(jìn)作用相比，在一定程度上，效果優(yōu)于香菇多糖.

表2 桂花多糖聯(lián)合Con A誘導(dǎo)的IL-2、IFN-γ 及TNF-α 指標(biāo)情況對(duì)比

4 小結(jié)

研究顯示[6-8]，植物多糖在抗腫瘤、免疫、心血管、抗衰老等方面都具有較為重要的作用，目前已經(jīng)成為廣大醫(yī)藥學(xué)工作者的研究熱點(diǎn).隨著分子生物學(xué)，生物化學(xué)等學(xué)科研究的發(fā)展，植物多糖的研究也越來越深入.同時(shí)，科學(xué)家們亦將多糖的研究提到了生命科學(xué)的前沿，提出了“二十一世紀(jì)是多糖的世紀(jì)”的概念.

本研究結(jié)果顯示，桂花多糖無顯著的細(xì)胞毒性，對(duì)淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的增殖轉(zhuǎn)化效果明顯，并且對(duì)IL-2、IFN-γ、TNF-α 的分泌有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，同時(shí)在一定程度上，隨著劑量增大，效果亦顯著，與香菇多糖的作用效果相當(dāng).

綜上，系統(tǒng)的研究桂花多糖的免疫活性，對(duì)其抗腫瘤作用的研究，奠定一定的基礎(chǔ).

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