張玲艷　高翔　王曉玲

【摘要】目的：篩選葒草的抗腫瘤活性部位。方法：采用CCK8法觀察葒草各提取部位對(duì)人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響情況。結(jié)果：葒草的乙酸乙酯部位對(duì)人肺癌A549及肝癌HepG2細(xì)胞的生存率降至49.16%及57.44%；正丁醇部位對(duì)人肺癌A549及肝癌HepG2細(xì)胞的生存率降至39.18%和46.57%，呈現(xiàn)時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論：葒草對(duì)人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞增值具有一定的抑制作用，是具有開發(fā)前景的抗腫瘤中藥。

【關(guān)鍵詞】葒草；CCK8法；體外抗腫瘤；活性部位

【中圖分類號(hào)】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2015）08-0033-02

葒草為蓼科植物紅蓼Polygonum orientale L.的干燥地上部分，具祛風(fēng)除濕、清熱解毒、活血、消積止痛之功，用于治療風(fēng)濕痹痛、頭痛、心胃氣痛、小兒疳積等癥[1]。其主要成分為黃酮類化合物[2]，且該成分有顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[3]。文獻(xiàn)報(bào)道葒草對(duì)一些腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，紅蓼的果實(shí)、莖葉也有一定的抗腫瘤作用[4-6]。本研究采用CCK8法，初步探討了葒草醇提液的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位對(duì)人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞體外活性的抑制情況，為葒草的進(jìn)一步研究及臨床抗腫瘤的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器酶標(biāo)儀（美國(guó)，Thermo Scientific Multiskan FC）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)，Thermo Fisher）；倒置相差顯微鏡（德國(guó)，徠卡DM500/DM750顯微鏡）；96孔培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）；電子分析天平（瑞士，梅特勒-托利多公司）；Mill-Q型超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2材料 葒草采自天津經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)張堅(jiān)鑒定為葒草Polygonum orientale L.的地上部分；胰蛋白酶、1640高糖培養(yǎng)基、胎牛血清為美國(guó)GIBCO公司；CCK8試劑盒為碧云天生物有限公司；其他試劑皆為分析純；水為由Mili-Q超純水；人肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

2方法

2.1供試品制備稱取葒草100g粉碎至60目，用3倍體積的60%的乙醇回流提取三次，每次1h，合并提取液，減壓回收溶劑得浸膏。依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，回收溶劑，減壓回收，得石油醚、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取部位。冷凍干燥呈粉末，精密稱取不同提取部分干燥粉末，用培養(yǎng)基制成10mg/ml母液，過0.22μm微孔濾器過濾除菌，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞接種于含10%胎牛血清100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的1640培養(yǎng)液中，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

2.3CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁腫瘤細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液后，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/ml，每孔接種100μl的細(xì)胞懸液于96孔培養(yǎng)板中，置于5%CO2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)12 h。每孔加入不同萃取部位藥物稀釋液，使其終濃度分別為50、100、150μg/ml，每組5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入相同體積培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2和飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)12h和24h。終止培養(yǎng)前1h，每孔加入100μl CCK8溶液，混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育1h后，于酶標(biāo)儀上490nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度OD值，按試劑盒說明，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率（%）=D（λ）實(shí)驗(yàn)組/D（λ）對(duì)照組×100%，則對(duì)照組存活率為100%。

2.4數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1不同濃度對(duì)細(xì)胞存活率的影響石油醚層對(duì)人肺癌A459和人肝癌HepG2細(xì)胞存活率均沒有影響（P>0.05）。乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)兩種細(xì)胞株均具有一定的抑制作用。與石油醚組相比，作用12h、50μg/ml的乙酸乙酯部位藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活率無(wú)顯著性差異。隨著乙酸乙酯部位濃度升高至100μg/ml時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞存活率分別降至70.46%和74.28%，200μg/ml時(shí)，兩種細(xì)胞存活率分別為56.74%和61.32%，與石油醚組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果顯示，乙酸乙酯部位出現(xiàn)良好的劑量依賴性。正丁醇部位在作用時(shí)間12h、濃度為50μg/ml時(shí)，A549細(xì)胞和HepG2細(xì)胞存活率分別為69.17%和78.59%，而200μg/ml正丁醇對(duì)兩種細(xì)胞的存活率影響分別為46.12和52.71%，與石油醚組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果顯示正丁醇部位對(duì)兩種細(xì)胞株也存在濃度-效應(yīng)關(guān)系。并且相同藥物濃度、相同作用時(shí)間時(shí)，正丁醇部位對(duì)于兩種細(xì)胞比乙酸乙酯更為敏感。

3.2不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞生存率影響相同濃度乙酸乙酯部位（100μg/ml）對(duì)A549細(xì)胞的存活率在12h和24h分別為70.46%和68.45%；HepG2細(xì)胞的存活率分別為74.28%和67.41%；正丁醇部位（100μg/ml）對(duì)A549細(xì)胞處理12h和24h，細(xì)胞存活率分別為64.19%和53.46%，而HepG2的影響分別為62.41%和58.43%，由此可見，隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用也隨之升高。

4討論

目前罹患癌癥的病例呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。癌癥是機(jī)體與外界環(huán)境因素長(zhǎng)期相互作用的結(jié)果，主要誘因有環(huán)境污染及諸如吸煙、不健康飲食、體力活動(dòng)少等不良的生活方式。我國(guó)肺癌及肝癌的發(fā)病率較高，死亡率在癌癥中也最高。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的深入，中藥在治療癌癥方面有了很大的進(jìn)展。葒草為民間及民族常用中藥，文獻(xiàn)報(bào)道其有一定的抗腫瘤作用[3]。本文通過對(duì)葒草不同溶劑萃取物對(duì)肺癌A549細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行體外活性的篩選，為其抗腫瘤活性研究及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及參考。

本實(shí)驗(yàn)通過CCK8法，對(duì)葒草醇提液的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位對(duì)人肺癌A549細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞進(jìn)行體外活性的抑制作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明乙酸乙酯、正丁醇2個(gè)萃取部位對(duì)人肺癌A549細(xì)胞和人肝癌HepG2細(xì)胞均有抑制增殖的作用影響，且正丁醇部位對(duì)上述兩種腫瘤細(xì)胞的增殖影響較大（生存率最低為39.18%和46.57%），比乙酸乙酯部位（最低值為49.16%、57.44%）抑制作用更明顯。說明葒草抗腫瘤的活性部位集中在大極性部分。并且，給藥劑量與給藥時(shí)間與腫瘤增殖抑制具有直接關(guān)系，隨著給藥劑量和給藥時(shí)間的增加，腫瘤細(xì)胞生存率降低，達(dá)到200μg/ml和24h時(shí)的影響最大。葒草的主要化學(xué)成分為黃酮類化合物，且黃酮類化合物具有一定的抗腫瘤作用，葒草的抗腫瘤活性是否與黃酮類成分的含量有關(guān)仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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（收稿日期：2015.01.22）