河春姬，楊 聲，董 穎，張力思，景 晶，徐友宣，吳侔天

1 前言

異體血液回輸是指向人體內(nèi)輸入血型相同的異體血液的方法，例如，A型血的人輸入他人提供的A型血液。這一方法在20世紀(jì)初被確立下來，隨后，普遍應(yīng)用于臨床治療。由于異體血液回輸能夠迅速增加紅細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體氧氣運輸，提高有氧運動能力，20世紀(jì)60年代，已有運動員通過使用血液回輸?shù)妊号d奮劑提高體育運動成績。在1988年漢城奧運會上，血液回輸作為血液興奮劑正式被國際奧委會（IOC）列入禁用范圍。近年來，由于對促紅細(xì)胞生成素和血液替代品興奮劑檢測水平的不斷進(jìn)步，使得采用血液回輸方法作弊再度流行［8］。

一直以來，研究人員都沒有找到理想的方法來檢測興奮劑異體血液回輸，一是，用以往的臨床檢驗技術(shù)無法區(qū)分是否輸入異體同型血液；二是，與受體紅細(xì)胞總數(shù)相比輸入的供體紅細(xì)胞比例很低，且紅細(xì)胞的數(shù)量和壽命隨著時間推移而縮減；再者，紅細(xì)胞屬于無核的終末分化的細(xì)胞，無法利用現(xiàn)有的遺傳學(xué)檢測技術(shù)根據(jù)核內(nèi)遺傳物質(zhì)脫氧核糖核酸（DNA）來鑒定其歸屬。

澳大利亞學(xué)者Nelson提出，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的血型血清學(xué)方法檢測運動員使用異體血液回輸，其原理是根據(jù)個體之間紅細(xì)胞血型抗原譜的差異，通過紅細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記方法，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)來檢測是否存在異體紅細(xì)胞［11，13，12］。2008年 ，Giraud、Arndt等 在 前 人 研 究 的 基 礎(chǔ) 上進(jìn)一步驗證并發(fā)展了該方法［10，6］。

流式細(xì)胞術(shù)是集激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)等于一體的生物技術(shù)，可對流過光學(xué)或電子檢測器的單個細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的多參數(shù)分析，近年在輸血醫(yī)學(xué)中有較廣泛的應(yīng)用。與普通紅細(xì)胞凝集實驗相比，流式細(xì)胞儀的最大特點是能夠根據(jù)不同的紅細(xì)胞抗原免疫熒光標(biāo)記，快速、靈敏、定量分析紅細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況，將異體紅細(xì)胞群區(qū)分開，并以圖形、數(shù)據(jù)形式直觀的將檢測結(jié)果呈現(xiàn)出來。

人類血型抗原是一個龐大的家族。1900年奧地利維也納大學(xué)卡爾·蘭德斯坦納發(fā)現(xiàn)了人類紅細(xì)胞ABO血型，從此揭開了血型的神秘面紗。國際輸血協(xié)會（ISBT）將目前已知并已證實的339個紅細(xì)胞血型抗原歸為33個血型系統(tǒng)、7個血型集合及2個血型系列。隨著新的血型抗原被發(fā)現(xiàn)，這些數(shù)字也不斷增長［4］。臨床異體輸血的原則是同型輸血，但通常只對血樣進(jìn)行ABO血型和Rh血型的檢驗，即使是對其他血型有特殊要求，也幾乎不可能找到擁有完全相同紅細(xì)胞血型抗原的供者（同卵雙生除外）。當(dāng)人體接受了異體輸血后，體內(nèi)就會存在紅細(xì)胞表面抗原性狀表達(dá)不同的兩種紅細(xì)胞群，因此，若能證明不同紅細(xì)胞群的存在就能判斷是否異體輸血。

本研究參考國外相同領(lǐng)域先進(jìn)實驗技術(shù)和方法，采用流式細(xì)胞技術(shù)對異體血液回輸?shù)臋z測方法進(jìn)行了適用性驗證研究，以證明使用流式細(xì)胞技術(shù)檢測異體血液回輸?shù)目煽啃院涂刹僮餍浴?/p>

2 材料與方法

2.1 實驗對象及樣品制備

本實驗對象為半年內(nèi)未接受過輸血的健康中國人12名，抽取靜脈血2.5ml，使用ABO血型檢測試劑檢測其ABO血型。其中A型血2人，B型血6人，O型血3人，AB型血1人，RhD血型均為陽性。

樣品制備人員將A、B、O血型相同且測定的8種血型抗原至少有2種不相同的單一血樣制備成體外混合血樣?；旌涎獦右罁?jù)紅細(xì)胞數(shù)按一定比例混合，混合比例分別為95%／5%、97%／3%、98.5%／1.5%、99.5%／0.5%，各 比例混合血樣的例數(shù)分別為8例，8例，8例，10例。樣品制備人員將所有單一和混合血樣編號后發(fā)放給檢測人員進(jìn)行檢測分析。

2.2 儀器和試劑

本實驗所用檢測儀器為美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)的FC500型號流式細(xì)胞儀。使用抗體為瑞士DiaMed公司生產(chǎn)的單克隆抗體產(chǎn)品，以及SEROTEC公司生產(chǎn)的FITC熒光標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白。

2.3 實驗方法

用細(xì)胞穩(wěn)定液將EDTA抗凝的新鮮血稀釋后，加入單克隆抗體，使之與相應(yīng)的紅細(xì)胞表面抗原結(jié)合，并用熒光素標(biāo)記的示蹤抗體標(biāo)記紅細(xì)胞表面抗原抗體復(fù)合物。使用流式細(xì)胞儀對紅細(xì)胞表面特定血型抗原的表達(dá)情況進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。通過對此方法檢測的特異性和靈敏度、信噪比和污染攜帶率、檢測樣品穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性等方面的檢測，驗證流式細(xì)胞儀檢測異體血液回輸方法的準(zhǔn)確性和可操作性。

3 實驗結(jié)果

3.1 抗原檢測特異性和靈敏度

經(jīng)檢測，這46例血樣的檢測判定結(jié)果為：12例單一血樣全部被檢出單峰并被準(zhǔn)確判為陰性（表1）。8例95%／5%和8例97%／3%比例混合的血樣均被檢測出兩個以上雙峰，所有應(yīng)為混合雙峰的樣品均被準(zhǔn)確檢出；8例98.5%／1.5%比例混合的血樣在應(yīng)出現(xiàn)雙峰的樣品圖中能被識別為雙峰，但個別抗體雙峰分離效果不佳，需進(jìn)行抗體優(yōu)化程序后方能被判定為雙峰；10例99.5%／0.5%比例混合的血樣中，只有4例樣品被判斷為含2個以上雙峰，其他混合樣品由于混合比例低于抗體檢測限而無法判定（圖1）。

表1 本研究12個單一血樣8種血型抗原的表達(dá)情況一覽表Table 1 The Phenotypes of Eight Blood Antigens in Twelve Samples

3.2 儀器信噪比和污染攜帶率

3.2.1 儀器信噪比

以8種抗體在95%／5%混合紅細(xì)胞樣品中只加入熒光示蹤抗體時，表達(dá)區(qū)域的紅細(xì)胞數(shù)占已設(shè)定的紅細(xì)胞區(qū)域內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比作為噪音，以3倍噪音作為該抗體的檢測限（表2）。

圖1 本研究紅細(xì)胞c抗原表型柱狀圖Figure 1. Histograms of RBC Antigen c

表2 本研究8種抗體檢測的噪音和檢測限一覽表Table 2 Noise and Limit of Detection for Eight Blood Antigens

3.2.2 污染攜帶率

根據(jù)流式細(xì)胞儀檢驗要求，在完成一次樣品檢測后立即檢測一支純水空白管，記錄30s內(nèi)紅細(xì)胞設(shè)定區(qū)域內(nèi)檢測到的顆粒數(shù)（N），重復(fù)200次，將檢測到的顆粒數(shù)相加，用此數(shù)值除以紅細(xì)胞設(shè)定區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞收集總數(shù)（A），并與重復(fù)次數(shù)作比，乘以100%得到污染攜帶率（CR）。公式為：

計算所得結(jié)果符合儀器廠商推薦的污染攜帶率小于1%的要求，說明儀器連續(xù)進(jìn)樣檢測不同樣品不會因進(jìn)樣器污染而導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

3.3 樣品穩(wěn)定性

在8例97%／3%混合的血樣和12例單一血樣中分別任意挑選1例，分別分裝在4個離心管中，冰箱4℃保存。在制備血樣的第1、5、14、28天分別對這兩例血樣進(jìn)行血型抗原檢測，測定血液樣品隨時間變化的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，經(jīng)過4周的冷藏存放，混合和單一血樣圖的鋒形及相對位置無顯著變化，檢測結(jié)果穩(wěn)定。

3.4 操作穩(wěn)定性

在46例血樣中選出6個樣品，其中包含單一血樣和各比例混合血樣。將其分裝成3份，分別由3位檢測人員完成對血型抗原的檢測，驗證不同操作者對檢測結(jié)果判定的一致性。結(jié)果顯示，3位檢測人員的檢測及判斷結(jié)果一致。

4 討論

4.1 方法驗證

本實驗應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的血型血清學(xué)方法對46例血樣進(jìn)行紅細(xì)胞血型抗原的檢測，其中，12例單一血樣的特異性驗證結(jié)果全部為陰性，符合世界反興奮劑機(jī)構(gòu)關(guān)于興奮劑檢測方法的檢測結(jié)果應(yīng)滿足100%陰性率和0%的假陽性率的特異性要求［14］。

對方法靈敏度的驗證結(jié)果顯示，3%及以上比例少量混合的紅細(xì)胞被檢出率達(dá)到100%。當(dāng)少量混合的紅細(xì)胞比例降低時，部分樣品某些抗原表達(dá)與非表達(dá)的紅細(xì)胞群分離效果不好，出現(xiàn)融合峰或拖尾峰影響判斷，此時進(jìn)行抗體優(yōu)化程序可以解決或改善峰形問題。而當(dāng)混合比例進(jìn)一步降低至0.5%少量混合時，除了峰形問題外，由于定量結(jié)果低于抗體檢測限而使混合血樣檢出率明顯降低。造成這一結(jié)果的原因可能有：1）紅細(xì)胞血型抗原密度和抗原性強(qiáng)弱不同，導(dǎo)致其與抗體結(jié)合能力存在差異；2）每種抗體效價不同，檢測限也有高低，其檢出能力由檢測限值最高的抗體決定；3）這8種抗體分別為單克隆抗體IgM和IgG，由于抗體結(jié)構(gòu)特點，結(jié)合了IgM抗體的紅細(xì)胞更易聚集，造成單細(xì)胞懸液制備不完全，聚集的多細(xì)胞被檢測為單細(xì)胞，導(dǎo)致定量結(jié)果低于檢測限，因此，盡管有的檢測人員能夠從柱狀圖上觀察到微弱的雙峰，但由于測定到的混合比例低于檢測限而不能將其判定為陽性。此外，流式細(xì)胞儀狀態(tài)也會對檢測結(jié)果造成影響，導(dǎo)致少量混合的紅細(xì)胞信號無法被檢測人員識別。

噪音和污染攜帶率影響了流式細(xì)胞儀的檢測能力，通過每次上機(jī)檢測前對儀器的校正以及對噪音和污染攜帶率的計算，來評估儀器狀態(tài)。儀器噪音過大，會掩蓋微弱的雙峰信號，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的判定，而污染攜帶率過高則可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。因此，在檢測過程中對儀器狀態(tài)的確認(rèn)是必要的。定期的維護(hù)和保養(yǎng)可以減少儀器本身對結(jié)果的影響。

人體血量約為4～5L，其中，循環(huán)血量約占總血量的4／5。有研究顯示，循環(huán)系統(tǒng)血紅蛋白增加5%可以提高運動能力［9］，輸血量太少則達(dá)不到增加血紅蛋白量進(jìn)而提高有氧耐力的目的。由于異體輸血伴隨感染、溶血、血液粘稠、疾病傳播等高風(fēng)險因素，采用極少量輸入多個供血者血液的可能性較小，因而，此方法的檢測靈敏度能夠滿足興奮劑檢測的需要。通常紅細(xì)胞在人體內(nèi)的壽命約120天，這意味著，在異體輸血后，理論上最多可以有長達(dá)3至4個月的檢測窗口期能夠檢測到異體血液回輸。相比傳統(tǒng)興奮劑只有幾天的檢測窗口期來說，該方法能夠大大提高興奮劑檢查的效率。

用細(xì)胞穩(wěn)定液稀釋的混合血樣在冷藏條件下至少可存放4周，以此模擬運動員進(jìn)行異體輸血后一段時間體內(nèi)不同紅細(xì)胞群的比例關(guān)系。在4周內(nèi)，不同操作人員對相同樣品測得的混合紅細(xì)胞群比例無明顯變化，說明此方法穩(wěn)定性好，可操作性高。

4.2 陽性判定

根據(jù)世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（WADA）對于免疫抗原法檢測興奮劑的要求，異體血液回輸陽性判定的標(biāo)準(zhǔn)為：在1份血樣中，當(dāng)有2個或2個以上特定紅細(xì)胞抗原存在多于1種表型時，判定為異體血液回輸陽性（AAF）；當(dāng)只有1個特定紅細(xì)胞抗原存在多于1種表型時，判定為可疑（ATF）［14］。正常情況下，每個人體內(nèi)所有紅細(xì)胞抗原的表達(dá)是唯一的，即要么表達(dá)，要么不表達(dá)，當(dāng)體內(nèi)某種紅細(xì)胞抗原同時存在表達(dá)與不表達(dá)的情況時（如圖1a），即存在兩種不同的紅細(xì)胞群，提示有異體輸血。當(dāng)然上述判定還需要排除嵌合體血型情況。

嵌合體血型多發(fā)生在異型輸血、異卵雙生、雙精受精和異型骨髓移植后。異型輸血、異型骨髓移植屬于獲得性嵌合（人工嵌合），異卵雙生、雙精受精是遺傳嵌合，屬于先天性嵌合。先天性嵌合，指在胚胎或妊娠時期形成的嵌合。先天性嵌合分兩種情況，一種是由于妊娠早期異卵雙生子之間存在血管交叉吻合，一方的造血干細(xì)胞經(jīng)由吻合的血管通路進(jìn)入到另一方體內(nèi)，在獲得性免疫耐受的基礎(chǔ)上，不同來源的造血干細(xì)胞分別產(chǎn)生兩群不同表型的紅細(xì)胞。另一種是在受精過程中，由2個卵細(xì)胞和2個精子相互結(jié)合而產(chǎn)生四倍體，四倍體受精卵繼續(xù)分裂就可能產(chǎn)生多種不同來源的細(xì)胞系。嵌合體現(xiàn)象會導(dǎo)致血型遺傳不符合經(jīng)典遺傳規(guī)律。此外，某些疾病也會導(dǎo)致嵌合體現(xiàn)象［2，3，5］。因此在采用本方法檢測發(fā)現(xiàn)異體血液回輸陽性時，運動員需進(jìn)行嵌合體血型鑒定，以排除先天性嵌合情況。

4.3 紅細(xì)胞血型抗原

血型是血液系統(tǒng)的一種遺傳多態(tài)性。傳統(tǒng)的血型概念指的就是紅細(xì)胞血型，是指能以抗體來分類的紅細(xì)胞抗原表型。紅細(xì)胞血型抗原是紅細(xì)胞表面的化學(xué)構(gòu)型，其形成的物質(zhì)基礎(chǔ)是紅細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)及結(jié)合到脂質(zhì)和蛋白質(zhì)上的糖分子。根據(jù)生化特性不同，紅細(xì)胞血型抗原可分為兩類，一類是由糖分子結(jié)構(gòu)決定的血型抗原，如ABO、Hh，Lewis，P，I等血型；另一類是由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定的血型抗原，如 Rh，MNS，Kell，Kidd，JK等血型。人類血型抗原由血型基因決定，同時受調(diào)控基因或修飾基因控制，具有個體差異性和種族差異性。

WADA對于流式細(xì)胞術(shù)檢測異體血液回輸?shù)姆椒ㄖ猩婕暗降募t細(xì)胞血型抗原的選擇未做明確規(guī)定，一般以紅細(xì)胞血型抗原表型在人群中表達(dá)的比例作為選擇依據(jù)，在人群中表達(dá)型和不表達(dá)型均占有一定比例的血型抗原可作為候選抗原。表3列出了不同研究、賽事及機(jī)構(gòu)選擇的血型抗原種類和數(shù)量。可以看出，盡管各研究根據(jù)人群表達(dá)情況不同，選擇的血型抗原有所差異，但是都包括本文研究的這8種基本的血型抗原。

表3 不同研究選擇的紅細(xì)胞血型抗原一覽表Table 3 Choice of Blood Antigens in Different Research

本研究選擇了8種公認(rèn)的在人群中有適當(dāng)比例分布的血型抗原進(jìn)行中國人樣本的檢測分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受試的11名中國人中最多有3人存在ABO血型及其他8種血型抗原表型完全一致的情況。換句話說，假如這3個人相互之間進(jìn)行異體輸血，且排除了紅細(xì)胞血型抗原密度的個體差異時，將不能被檢測為陽性。理想狀態(tài)下，能夠檢測的候選紅細(xì)胞血型抗原種類越多，檢測的假陰性率就越低，但對于大樣本量的實際興奮劑檢測工作來說，可操作性較差。因此，科學(xué)地選擇紅細(xì)胞抗原種類進(jìn)行檢測，可以有效提高興奮劑檢測效率。李晟瑋［1］對Rh、Kell、Duffy、Kidd、Lewis、P、MNS和Luth等系統(tǒng)中的21個候選血型抗原進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)其中 Leb、E、Jka、Jkb、M、C、e、c等血型抗原更適合于檢測中國人群異體血液回輸，并發(fā)現(xiàn)增加檢測血型抗原的數(shù)量，能夠有效減少異體輸血檢測假陰性發(fā)生的概率。意大利的Donati等人也有類似報道，他們發(fā)現(xiàn)，在8種基本血型抗原的基礎(chǔ)上增加另外5種（e，s，K，Lea，Leb）血型抗原后，能夠提高混合血樣的檢出率［7］。然而，在實際興奮劑檢測工作中，實驗室檢測人員無法得知所檢測樣品的運動員個人信息，這為根據(jù)不同種族運動員選擇不同血型抗原的個性化的檢測手段的實施帶來一定難度。因此，在近兩屆奧運會異體血液回輸?shù)呐d奮劑檢測中，都只選擇了這8種基本血型抗原進(jìn)行檢測。

5 小結(jié)

利用流式細(xì)胞技術(shù)能夠很好的檢測和區(qū)分小比例混合后血液中存在的不同紅細(xì)胞群，有效檢測運動員非法使用異體回輸血液興奮劑。目前，這一方法已通過了世界反興奮劑機(jī)構(gòu)和中國合格評定國家認(rèn)可委員會認(rèn)可，并已應(yīng)用于常規(guī)檢測和奧運會等大型賽事的異體血液回輸興奮劑檢測中。

［1］李晟瑋.血液興奮劑異體同型輸血檢測方法的研究［D］.北京：北京體育大學(xué)，2009.

［2］柳燕，趙珍敏，林源.2例親權(quán)鑒定案中的嵌合體STR譜分析［J］.中國司法鑒定，2012，（4）：68－76.

［3］喻瓊，鄭巖.嵌合體血型的研究進(jìn)展［J］.中國輸血雜志，2010，23（2），146－148.

［4］張印則，徐華，周華友.紅細(xì)胞血型原理與檢測策略［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014.

［5］朱培元，嚴(yán)京梅，薛敏，等.雙精子嵌合體致ABO血型正反定型不符1例［J］.臨床輸血與檢驗，2014，16（1）：28－30.

［6］ARNDT P A，KUMPEL B M.Blood doping in athletes－detection of allogeneic blood transfusions by flow cytofluorometry［J］.Am J Hematol，2008，83（8）：657－667.

［7］DONATI F，STAMPELLA A，DE LA TORRE X，et al.Investigation on the application of DNA forensic human identification techniques to detect homologous bloodtransfusions in doping control［J］.Talanta，2013，15（110）：28－31.

［8］MELIOLI G，D’ONOFRIO G.Blood doping：present procedures and detection techniques［J］.Expert Rev Endocrinol Metabolism，2006，1（6）：793－800.

［9］GLEDHILL N.Blood doping and related issues：a brief review［J］.Med Sci Sports Exe，1992，（12）：182－189.

［10］GIRAUD S，ROBINSON N，MANGIN P，et al.Scientific and forensic standards for homologous blood transfusion anti－doping analyses［J］.Forensic Sci Int，2008，179（1）：23－33.

［11］NELSON M，ASHENDEN M，LANGSHAW M，et al.Detection of homologous blood transfusion by flow cytometry：a deterrent against blood doping［J］.Haematologica，2002，87（8）：881－882.

［12］NELSON M，COOPER S，NAKHLA S，et al.Validation of a test designed to detect blood－doping of elite athletes by homologous transfusion［J］.Aus J Med Sci，2004，25（1）：27－33.

［13］NELSON M，POPP H，SHARPE K，et al.Proof of homologous blood transfusion through quantification of blood group antigens［J］.Haematologica，2003，88（11）：1284－1295.

［14］WADA－ISL－2012.International standard for laboratory［S］.