陳濤 陳亮 李海成 郭卉欣 林東子 王威 李玉美 余麗 黎貞燕 孫琦 黃新春 李國周 周杰 趙梅桂 鐘球 周琳

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結(jié)核抗原誘導(dǎo)的人外周血細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在結(jié)核病診斷中的價(jià)值

陳濤 陳亮 李海成 郭卉欣 林東子 王威 李玉美 余麗 黎貞燕 孫琦 黃新春 李國周 周杰 趙梅桂 鐘球 周琳

目的 γ-干擾素(IFN-γ)釋放試驗(yàn)(IGRA)是目前廣泛運(yùn)用的結(jié)核病篩查和診斷技術(shù)，但其無法區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核感染(LTBI)。本研究旨在發(fā)現(xiàn)更加合適的血清標(biāo)志物(細(xì)胞因子)可以替換IGRA，用于活動(dòng)性結(jié)核病的診斷和LTBI者的篩查，以及這些細(xì)胞因子之間的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。方法 40份健康人(簡稱“健康組”)血液樣本，40份確診為活動(dòng)性肺結(jié)核患者(簡稱“肺結(jié)核組”)的血液樣本，40份LTBI者(簡稱“LTBI組”)的血液樣本；通過結(jié)核分枝桿菌特異性抗原[早期分泌抗原靶6(ESAT6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)]進(jìn)行刺激；通過人細(xì)胞因子芯片對刺激后的細(xì)胞因子表達(dá)變化進(jìn)行檢測；并篩選顯著變化的因子，進(jìn)行細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。結(jié)果 在肺結(jié)核組患者的外周血中嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白(CCL)1(I-309)、趨化因子CXCL9[又稱為Mig,即monokine induced by IFN-γ(IFN-γ誘導(dǎo)的單核因子)]、白細(xì)胞介素(IL)10、IL6、集落刺激因子(CSF)2、CSF3、IL8、IL1α、IL7、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、CCL2、 IL2、IL13、腫瘤壞死因子(TNF)α等因子在結(jié)核特異性抗原刺激后顯著上調(diào)(2.06倍至3.18倍)；而在健康組和LTBI組當(dāng)中卻沒有顯著上調(diào)。在肺結(jié)核組和LTBI組患者的外周血中CCL3、IL1b、CCL8、IFN-γ、CXCL10因子在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后明顯上調(diào)(2.44倍至11.56倍)；而在健康組中這些因子沒有明顯的上調(diào)。趨化因子CCL4和巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-1α因子在健康組、LTBI組和肺結(jié)核組外周血中，經(jīng)過結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后，表達(dá)都明顯上調(diào)。細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示，這些表達(dá)上調(diào)的因子，主要集中于IFN-γ和IL1α因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中。結(jié)論 CXCL10(IP-10)、CCL3、CCL8和IL1β因子可能比IFN-γ更適合用于結(jié)核病或LTBI者的篩查。

結(jié)核, 肺/診斷； 細(xì)胞因子類； 抗原, 細(xì)菌； 細(xì)菌蛋白質(zhì)類； 生物學(xué)標(biāo)記

結(jié)核病依然是目前全球最為嚴(yán)重的傳染性疾病，根據(jù)WHO 2014年全球結(jié)核病報(bào)告統(tǒng)計(jì)(Globaltuberculosisreport2014. WHO/HTM/TB/2014.08.)，全球結(jié)核分枝桿菌的感染人數(shù)達(dá)到了1/3，也就是有近20億的潛伏結(jié)核感染(LTBI)者，其中大概有5%～10%會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。根據(jù)2014年中國CDC統(tǒng)計(jì)，2012年全國死于結(jié)核病的患者有25萬例，是所有其他傳染性疾病導(dǎo)致死亡例數(shù)的2倍?？梢?，結(jié)核病依然是威脅人類健康的重大問題，然而，我們目前還缺乏非常有效的控制方法。

對結(jié)核病的控制，最有效的辦法就是早期診斷和提前干預(yù)[1]。目前對活動(dòng)性結(jié)核病的診斷和LTBI者的篩查，臨床常用的是γ-干擾素(IFN-γ)釋放試驗(yàn)(interferon-gamma release assays，IGRA)。其原理是通過結(jié)核特異性抗原刺激外周血中的結(jié)核特異性T細(xì)胞釋放γ-干擾素(IFN-γ)，來判斷是否被結(jié)核分枝桿菌感染過。IGRA檢測結(jié)核分枝桿菌感染，敏感度高，特異度好；但是，由于IFN-γ來源于活動(dòng)性T細(xì)胞，也來源于靜息T細(xì)胞，而且二者在受到結(jié)核特異性抗原刺激的時(shí)候，釋放的干擾素水平相當(dāng)，因此它不能區(qū)分LTBI和活動(dòng)性結(jié)核病[2-3]。尤其在結(jié)核感染人數(shù)如此眾多而發(fā)病率又不高的情況下，區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI是非常有必要的。因此，篩選新的活動(dòng)性結(jié)核病標(biāo)志物是非常重要的。

目前，對于結(jié)核新標(biāo)志物的篩查，主要是采用細(xì)胞因子芯片對活動(dòng)性結(jié)核病患者、LTBI者和健康人的血清直接進(jìn)行差異分析[4-5]，或者是采用結(jié)核特異性抗原對活動(dòng)性結(jié)核病患者、LTBI者或者健康人外周血進(jìn)行刺激后，再采用芯片對外周血上清進(jìn)行分析[6-13]；或者是提取活動(dòng)性結(jié)核病患者、LTBI者、健康人外周血中的白細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并采用結(jié)核特異性抗原進(jìn)行刺激，然后研究其分泌因子的差異[14]。所有的這些研究，由于采用的芯片的因子數(shù)量少而且各不相同，無法得出一致的結(jié)果。因此，需要一個(gè)更加系統(tǒng)的方法對所有的這些因子進(jìn)行分析。

本研究采用結(jié)核特異性抗原對活動(dòng)性肺結(jié)核患者、LTBI者和健康人的外周血進(jìn)行刺激，然后通過高通量細(xì)胞因子芯片對刺激后外周血中細(xì)胞因子的表達(dá)變化進(jìn)行檢測，并結(jié)合已經(jīng)報(bào)道的結(jié)核分枝桿菌潛在標(biāo)志物，對所有的潛在標(biāo)志物構(gòu)建細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期發(fā)現(xiàn)較IFN-γ更加合適的細(xì)胞因子，可以用于結(jié)核感染的快速診斷，以及對LTBI者和活動(dòng)性結(jié)核病患者進(jìn)行快速鑒別。

材料與方法

一、樣本收集

本研究獲得當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)(廣東省結(jié)核病控制中心)，并取得患者的書面知情同意。本研究共征集了120份外周血樣，其中40份為健康人(簡稱“健康組”)對照血樣，40份確診為活動(dòng)性肺結(jié)核患者(簡稱“肺結(jié)核組”)血樣，40份確診為LTBI者(簡稱“LTBI組”)血樣。每份血樣3 ml，并采用肝素鈉進(jìn)行抗凝處理。其中健康組40名，經(jīng)影像學(xué)檢查沒有發(fā)現(xiàn)任何結(jié)核病征象，同時(shí)沒有任何結(jié)核病的臨床癥狀，以及IGRA檢測結(jié)果為陰性。40例LTBI組成員的IGRA檢測結(jié)果陽性，但是沒有其他任何結(jié)核病臨床癥狀。40例肺結(jié)核組患者在結(jié)核病?？漆t(yī)院確診，診斷標(biāo)準(zhǔn)為：患者臨床癥狀有咳痰、咯血；影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肺部陰影；IGRA檢測陽性，痰涂片檢測陽性，部分樣本痰培養(yǎng)陽性；同時(shí)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的抗結(jié)核藥物治療，癥狀明顯減輕，且經(jīng)過6個(gè)月的抗結(jié)核藥物治療后，全部治愈，血液樣本在初診為結(jié)核病且在治療之前收集。

二、血漿細(xì)胞因子芯片檢測

商業(yè)化人細(xì)胞因子檢測芯片(美國RayBiotech公司)被用于測定血漿樣品中40種細(xì)胞因子的表達(dá)水平變化。芯片檢測過程按照說明書要求進(jìn)行：每張芯片先用100 μl封閉液室溫封閉2 h后；加入100 μl 的血漿樣品置于4 °C過夜孵育；采用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗去未結(jié)合的樣本；后加入100 μl生物素化的混合檢測抗體室溫孵育2 h；采用PBST洗去未結(jié)合的抗體；后加入100 μl的三甲川3H-吲哚菁染料(Cy3)標(biāo)記的鏈霉親和素室溫反應(yīng)1 h；采用PBST洗去未結(jié)合的Cy3標(biāo)記的聯(lián)袂親和素后，采用Genepix4000B激光掃描儀(Axon公司, 美國)進(jìn)行掃描，并獲取每個(gè)點(diǎn)的信號值。

三、IGRA檢測

結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫檢測試劑(ELISA)購買自武漢海吉利生物制品有限公司。整個(gè)實(shí)驗(yàn)分析過程按照說明書要求進(jìn)行。每份3 ml新鮮血樣分成3等份，分別采用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原[早期分泌抗原靶6(ESAT6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP10)]、磷酸鹽緩沖液(PBS)(陰性對照)、外源凝集素(陽性對照)進(jìn)行刺激。37 ℃水浴刺激20 h后，4000g離心10 min，收集血漿，IFN-γ定量檢測試劑盒檢測血漿中IFN-γ的水平。結(jié)果按照說明書要求采用表1所列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

表1 IGRA檢測的判讀標(biāo)準(zhǔn)

圖1～4 細(xì)胞因子芯片分析外周血經(jīng)過結(jié)核分枝桿菌抗原(ESAT6和CFP10)刺激后細(xì)胞因子的表達(dá)變化。圖1示健康組標(biāo)本經(jīng)PBS 刺激后；圖2示LTBI組標(biāo)本經(jīng)結(jié)核分枝桿菌抗原刺激后； 圖3示健康組標(biāo)本經(jīng)結(jié)核分枝桿菌抗原刺激后；圖4示肺結(jié)核組患者標(biāo)本經(jīng)結(jié)核分枝桿菌抗原刺激后

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。雙尾Mann-Whitney檢驗(yàn)用于細(xì)胞因子表達(dá)差異分析。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。差異表達(dá)細(xì)胞因子采用歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(EMBL)的String在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析。

結(jié) 果

一、IGRA無法區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和TLBI

為了篩查與結(jié)核相關(guān)的細(xì)胞因子，我們采用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原對新鮮外周血進(jìn)行刺激，然后采用高通量細(xì)胞因子芯片對血漿中的40個(gè)常見細(xì)胞因子濃度進(jìn)行檢測(圖1～4)。以健康人血液經(jīng)過PBS刺激為基準(zhǔn)，分析不同組血液樣本經(jīng)過結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后每個(gè)細(xì)胞因子表達(dá)變化的情況(采用倍數(shù)表示)，以及差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。圖5顯示，IFN-γ因子無論是在活動(dòng)性結(jié)核病患者組或LTBI感染組，在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后都有明顯的上調(diào)[分別是2.44倍(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，t=3.52，P=0.001)和2.16倍(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，t=3.045，P=0.001)]，而且二者上調(diào)倍數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，t=3.43，P=0.231)。因此，IGRA無法用于區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI。健康人群組的血液標(biāo)本經(jīng)過結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后，IFN-γ也有輕微的上調(diào)[1.25倍(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，t=2.01，P<0.05)]。同時(shí)，與健康人結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激比較，結(jié)核病組和LTBI組，IFNg上調(diào)的倍數(shù)明顯要高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，t值分別為3.66、3.34，P值均為0.001)。

二、診斷活動(dòng)性結(jié)核病的標(biāo)志物

好的活動(dòng)性結(jié)核病診斷指標(biāo)，應(yīng)該在結(jié)核病患者中經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后顯著上調(diào)，而在健康人群中和LTBI者中沒有明顯的變化。因此，筆者規(guī)定診斷活動(dòng)性結(jié)核病的標(biāo)志物必須滿足以下條件：①(健康組+結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激)檢測結(jié)果/(健康組+PBS刺激)檢測結(jié)果的比值<1.2；②(肺結(jié)核組+結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激)檢測結(jié)果/(健康組+PBS刺激)檢測結(jié)果的比值>2；③(LTBI組+結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激)檢測結(jié)果/(健康組+PBS刺激)檢測結(jié)果的比值<1.5。本研究發(fā)現(xiàn)：嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白(CCL)1(I-309)、趨化因子CXCL9[又稱為Mig,即monokine inducedbyIFN-γ(IFN-γ誘導(dǎo)的單核因子)]、白細(xì)胞介素(IL)10、IL6、集落刺激因子(CSF)2、CSF3、IL8、IL1A、IL7、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、CCL2、 IL2、IL13、腫瘤壞死因子(TNF)α等因子符合條件。上述細(xì)胞因子在各組加結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后檢測的變化水平見表2。

IL：白細(xì)胞介素；CSF：集落刺激因子；CXCL：趨化因子；CCL：嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白；TGF：轉(zhuǎn)化生長因子；TNF：腫瘤壞死因子；IFN：干擾素；PDGF：血小板源性生長因子；TIMP：金屬蛋白酶組織抑制因子；MIP：巨噬細(xì)胞炎性蛋白；ICAM：細(xì)胞間黏附分子圖5 細(xì)胞因子芯片分析外周血經(jīng)過結(jié)核分枝桿菌抗原(ESAT6和CFP10)刺激后各個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)水平的差異

三、結(jié)核病篩查指標(biāo)

好的結(jié)核病篩查指標(biāo)，應(yīng)該能夠同時(shí)發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI。因此，理論上講結(jié)核病篩查標(biāo)志物應(yīng)該在結(jié)核病患者和LTBI者的血液標(biāo)本經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后都明顯上調(diào)，而在健康人應(yīng)該沒有明顯的變化。因此，筆者規(guī)定結(jié)核病篩查標(biāo)志物必須滿足以下條件：①(健康組+結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激)檢測結(jié)果/(健康組+PBS刺激)檢測結(jié)果的比值<1.2；②(肺結(jié)核組+結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激)檢測結(jié)果/(健康組+PBS刺激)檢測結(jié)果的比值>2；③(LTBI組+結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激)檢測結(jié)果/(健康組+PBS刺激)檢測結(jié)果的比值>2。本研究發(fā)現(xiàn)只有：CCL8、IFN-γ、CXCL10因子符合條件。CCL3和IL1b兩個(gè)因子，雖然(健康組+結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激)檢測結(jié)果/(健康組+PBS刺激)檢測結(jié)果的比值>1.2，但是“(肺結(jié)核組+結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激)檢測結(jié)果/(健康組+PBS刺激)檢測結(jié)果的比值”和“(LTBI組+結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激)檢測結(jié)果/(健康組+PBS刺激)檢測結(jié)果的比值”上調(diào)倍數(shù)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)>2，所以，可能也是潛在的結(jié)核病篩查因子(表3)。

表2 診斷活動(dòng)性結(jié)核病的潛在標(biāo)志物(細(xì)胞因子)在各組加結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后檢測的變化水平(比值)

表3 結(jié)核病篩查潛在標(biāo)志物(細(xì)胞因子)在各組加結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后檢測的變化水平(比值)

IL：白細(xì)胞介素；CSF：集落刺激因子；CXCL：趨化因子；CCL：嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白；TGF：轉(zhuǎn)化生長因子；TNF：腫瘤壞死因子；IFN：干擾素；PDGFA：血小板源性生長因子A；TIMP：金屬蛋白酶組織抑制因子；MIP：巨噬細(xì)胞炎性蛋白；ICAM：細(xì)胞間黏附分子圖6 結(jié)核分枝桿菌特異性抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子之間的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

四、非特異性細(xì)胞因子

此外，筆者發(fā)現(xiàn)CCL4和巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-1α因子，無論是在健康組、肺結(jié)核組和LTBI組當(dāng)中，受到外來結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激的時(shí)候都會(huì)顯著上調(diào)。因此，這2個(gè)因子可能是非特異性細(xì)胞因子。

五、結(jié)核分枝桿菌特異性抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞因子之間的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

一個(gè)好的標(biāo)志物，應(yīng)該是由結(jié)核分枝桿菌特異性效應(yīng)T細(xì)胞受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后直接分泌的因子，而不是由巨噬細(xì)胞或其他非特異性T細(xì)胞受到抗原刺激后產(chǎn)生的因子，否則標(biāo)志物的特異性不強(qiáng)。因此，筆者研究了這25個(gè)表達(dá)上調(diào)的細(xì)胞因子之間的相互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖6)。從圖6中可以看到，上述細(xì)胞因子主要受IFN-γ、IL11、IL1a、IL7等4個(gè)細(xì)胞因子調(diào)控。IL1β、IL6、IL17a、IL2、SCF2、IL5等6個(gè)細(xì)胞因子處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中游，可能起到放大的作用。而CXCL9、CXCL10(IP-10)、IL8、IL15、CCL2、CCL3處于上述25個(gè)細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的下游階段，可能直接發(fā)揮作用。而IL10 在這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中可能主要起到負(fù)調(diào)控的作用，其對多個(gè)細(xì)胞因子都起到負(fù)調(diào)節(jié)的作用，包括IL6、IL8、IL2、CSF2、CCL2、CSF3，而其自身主要又受到CSF3的促進(jìn)調(diào)節(jié)。因此，IL10和CSF3之間可能通過這樣的一種相互調(diào)控，達(dá)到一種平衡。此外，還有TGF-β1，CCL4、CCL8、血小板源性生長因子B(PDGFB)、骨細(xì)胞生長營養(yǎng)素(osteocyte growth nutritive，OGN)等細(xì)胞因子獨(dú)立于這25個(gè)細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之外。他們有可能是由T、B或巨噬細(xì)胞受到抗原刺激后直接分泌的。

討 論

活動(dòng)性結(jié)核病的診斷和LTBI篩查的標(biāo)志物人們一直在研究，卻沒有新的突破。筆者采用高通量細(xì)胞因子芯片，將結(jié)核分枝桿菌特異性抗原(ESAT6 和CFP10)對肺結(jié)核組、LTBI組和健康組的外周血進(jìn)行刺激后，檢測血清中的相關(guān)細(xì)胞因子，并對這些表達(dá)受到調(diào)控的細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)了一些可以用于活動(dòng)性結(jié)核病診斷和LTBI進(jìn)行大規(guī)模篩查的新標(biāo)志物。

一、適宜結(jié)核感染篩查的細(xì)胞因子

本研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后，IFN-γ在肺結(jié)核組和LTBI組中都顯著上調(diào)，但上調(diào)程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此無法用于活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI的鑒別，這與前人的研究結(jié)果相符合[3]。同時(shí)筆者發(fā)現(xiàn)，IP-10因子和IFN-γ一樣，在肺結(jié)核組和LTBI組中的表達(dá)都上調(diào)，而且IP-10在LTBI組中上調(diào)的倍數(shù)比在肺結(jié)核組中上調(diào)得更明顯，因此IP-10也只適合于LTBI的篩查，而不是活動(dòng)性結(jié)核病的診斷，這與以前的研究一致[15-16]。從細(xì)胞因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可以看出，IP-10其實(shí)也是處于IFN-γ因子的調(diào)控下，故其與IFN-γ有著相同的表現(xiàn)并不奇怪。不過IP-10較IFN-γ在血清中的濃度要高出很多，更容易檢測，而且刺激后的變化更明顯；因此，IP-10 可能可以取代IFN-γ用于LTBI的篩查。此外，在本研究中還發(fā)現(xiàn)：CCL8[單核細(xì)胞趨化蛋白2(MCP2)]、IL1b、CCL3(MIP-1α)3個(gè)因子，同樣在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后，在肺結(jié)核組和LTBI組中明顯上調(diào)。IL1b已經(jīng)有報(bào)道在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后顯著上調(diào)[17]，從圖6可以看出IL1b也受IFN-γ調(diào)控。而筆者首次發(fā)現(xiàn)MCP2和MIP-1α兩個(gè)因子在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后上調(diào)非常顯著，尤其是MCP2，在健康人中，幾乎沒有變化，而在活動(dòng)性結(jié)核病患者和LTBI者中有著2.5倍的上調(diào)。因此，也可以用于結(jié)核感染的篩查。

二、可用于活動(dòng)性結(jié)核病診斷的細(xì)胞因子

本研究發(fā)現(xiàn)CCL1(I-309)、CXCL9(MIG)、IL10、IL6、CSF2、CSF3、IL8、IL1a、IL7、TGF-β1、CCL2、 IL2、IL13、TNFα因子在活動(dòng)性結(jié)核病患者中的表達(dá)變化明顯。其中部分因子在前人的研究中已經(jīng)有過報(bào)道，比如I-309 因子在以前的報(bào)道中都已經(jīng)證實(shí)在樹突細(xì)胞經(jīng)過結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激會(huì)上調(diào)[18-19]，CXCL9(MIG)[20]、IL10[21]、IL6[22]、IL7、IL8[23-26]、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)[27]在相應(yīng)的文章中都已有報(bào)道。其中IL10是個(gè)抗炎癥因子，在免疫調(diào)控中主要起到逆調(diào)控因子作用[28]，從圖6可以看出，IL10處在CSF2和CSF3的調(diào)控下，因此，其有可能是一個(gè)非特異性因子，在感染中起到維持免疫反應(yīng)不適于過強(qiáng)。因此，可能不是一個(gè)結(jié)核病診斷的特異性指標(biāo)。IL10可能通過與CSF3和CSF2的相互調(diào)控達(dá)到平衡。IL6、IL2處于網(wǎng)絡(luò)的中間層，主要受到IFN-γ和IL1a、IL11和IL17的調(diào)控，同時(shí)又調(diào)節(jié)其他因子的表達(dá)；因此，IL6、IL2可能起到中間放大作用，同樣可能也是非特異性的因子。TNFα調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，獨(dú)立于這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之外。同樣已經(jīng)有研究證實(shí)，TNFα在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后上調(diào)[29]。TGF-β2已經(jīng)有研究證明，其在結(jié)核分枝桿菌刺激后上調(diào)[29-30]；從圖6中看，其獨(dú)立于IFN-γ信號通路，因此可能有自己的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這需要更多的后續(xù)研究來證實(shí)。IFN-γ、IL1a、IL7、IL11雖然都處于整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游，但是IFN-γ在LTBI者和活動(dòng)性結(jié)核病患者中表達(dá)都上調(diào)，只有IL1a、IL7、IL11卻在活動(dòng)性結(jié)核病患者中表達(dá)上調(diào)。因此，這可能是活動(dòng)性結(jié)核病區(qū)分于LTBI的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；應(yīng)該增加對這些因子的研究，通過多因子聯(lián)合檢測來區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和LTBI。但是，從細(xì)胞因子相互調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)上講，IL1a、IL7可能更具有診斷價(jià)值，因?yàn)榫幱诰W(wǎng)絡(luò)的上游，可能是由結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激結(jié)核分枝桿菌特異性效應(yīng)T細(xì)胞而表達(dá)的。當(dāng)然，對于IL1a和IL7的細(xì)胞表達(dá)來源還要做進(jìn)一步的研究，在診斷的敏感度和特異度上還有待更大樣本的驗(yàn)證。

圖6還可以看到，IFN-γ在這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中是一個(gè)很重要的細(xì)胞因子，很多的因子都在其調(diào)控的下游，包括CXCL9、CXCL10、IL1B、IL6、IL15。IFN-γ很可能是結(jié)核分枝桿菌特異性效應(yīng)T細(xì)胞受到結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后分泌的特異性因子，因此，是一個(gè)很好的特異性標(biāo)志物。同樣IL1A、IL7也是。CXCL10也就是IP-10 因子，雖然在很多文獻(xiàn)中都報(bào)道其與LTBI有著非常密切的關(guān)聯(lián)[31-32]，可能可以作為LTBI篩查的標(biāo)志物，但是它也是處于IFN-γ的調(diào)控下。

本研究從細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)揭示了各個(gè)因子之間的相互調(diào)控作用，并發(fā)現(xiàn)了一些新的標(biāo)志物有可能用于LTBI的篩查和活動(dòng)性結(jié)核病患者的診斷。尤其是多個(gè)指標(biāo)的聯(lián)合運(yùn)用可提高敏感度和特異度。但是，本研究還存在一些缺陷，首先樣本量不足。同時(shí)，研究指標(biāo)不足，筆者只研究了其中40個(gè)炎癥因子的表達(dá)變化；為了得到更加完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還需要研究更多的與免疫相關(guān)的因子，這也將是以后研究的一個(gè)重要方向。

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(本文編輯：薛愛華)

Value ofMycobacteriumtuberculosisantigen-induced human peripheral blood cytokine regulatory network in the diagnosis of tuberculosis

CHENTao,CHENLiang,LIHai-cheng,GUOHui-xin,LINDong-zi,WANGWei,LIYu-mei,YULi,LIZhen-yan,SUNQi,HUANGXin-chun,LIGuo-zhou,ZHOUJie,ZHAOMei-gui,ZHONGQiu,ZHOULin.

CenterforTuberculosisControlofGuangdongProvince,Guangzhou510630,China

s:ZHONGQiu,Email:zhongqiu@vip.163.com;ZHOULin,Email:zhoulinpaper@vip.163.com;ZHAOMei-gui,Email:bazmg@126.com

Objective IFN-γ release assay (IGRA) is widely used for tuberculosis (TB) screening and diagnosis currently. But it can’t distinguish between active tuberculosis and latent tuberculosis (LTB). The aim of this study was to find more appropriate serum markers and their regulatory networks as alternatives to IFN-γ, for active tuberculosis diagnosis and tuberculosis latent infection screening. Methods Forty healthy control blood samples, 40 diagnosed pulmonary tuberculosis patients blood samples, 40 TB latent infected blood samples were stimulated with specific antigens ofMycobacteriumtuberculosisESAT-6 and CFP-10; the cytokines expression were profiled with human cytokine array; and the significant changes cytokines were used to cytokine regulation network construction. Results CCL1 (I-309), CXCL9 (MIG), IL10, IL6, CSF2, CSF3, IL8, IL1α, IL7, TGF-β1, CCL2, IL2, IL13, TNFα were significantly upregulated from 2.06 to 3.18 timesin patients with active pulmonary tuberculosis after tuberculosis specific antigen stimulation; CCL3, IL1β, CCL8, IFN-γ, CXCL10 were significantly upregulated from 2.44 to 11.56 times in the active tuberculosis and latent TB infection; CCL4 and MIP-1α were up-regulated in all these three groups afterMycobacteriumtuberculosisspecific antigen stimulation. Cytokine regulatory networks show that these up-regulated cytokines are mainly concentrated in the IFN-γ and IL1α regulatory networks. Conclusion CXCL10 (IP-10), CCL3, CCL8 and IL1β may be more suitable for tuberculosis or latent tuberculosis screening than IFN-γ.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Cytokines； Antigens, bacterial； Bacterial proteins； Biological markers

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.08.007

“十二五” 國家科技重大專項(xiàng)(2014ZX10003002-003)；廣東省科技計(jì)劃(2014A020212238)；廣東省衛(wèi)生科技項(xiàng)目(C2013008/C2012008)

510630 廣州，廣東省結(jié)核病控制中心(陳濤、陳亮、李海成、郭卉欣、孫琦，鐘球、周琳)；深圳市寶市安區(qū)慢性病防治院結(jié)核病防治科(趙梅桂)；佛山市第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科(周杰、王威)；暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室(黎貞燕、黃新春)；華南理工大學(xué)輕工食品學(xué)院(余麗)；東莞市慢性病防治院檢驗(yàn)科(林東子、李玉美、李國周)

注：陳濤、陳亮對本研究具有同等貢獻(xiàn)，為并列第一作者

周琳，Email：zhoulinpaper@163.com；鐘球，Email：zhongqiu@vip.163.com; 趙梅桂，Email：bazmg@126.com

2015-07-03)