朱 韜 鄭有卯

雷公藤紅素誘導人骨肉瘤細胞系HOS凋亡及機制研究

朱 韜 鄭有卯

目的 探討雷公藤紅素對人骨肉瘤細胞HOS的殺傷作用及其機制。方法 將人骨肉瘤細胞HOS用各種不同濃度的雷公藤紅素治療后，采用MTT法檢測雷公藤紅素對HOS細胞活力的抑制作用；采用流式細胞術檢測HOS細胞凋亡及活性氧簇（ROS）的產生情況；Western blot檢測HOS細胞cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和磷酸化JNK的表達水平。結果 雷公藤紅素對HOS細胞活力的抑制效應呈劑量依賴性，1、2、3、4、5μmol/L的雷公藤紅素組細胞活力抑制率分別為（23.6±3.5）%、（43.7±5.4）%、（57.8±6.9）%、（75.5±6.4）%、（83.7±7.3）%，各雷公藤組細胞活力抑制力與對照組的零抑制力比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）；雷公藤紅素可顯著誘導HOS細胞發(fā)生凋亡，與對照組凋亡率（2.3±0.5）%比較，1、3μmol/L雷公藤紅素組凋亡率分別為（17.2±2.2）%（P＜0.05）、（39.5±3.6）%（P＜0.05）。雷公藤紅素可顯著誘導HOS細胞ROS的產生，與對照組ROS陽性率（1.3±0.4）%比較，1、3μmol/L雷公藤紅素組ROS陽性率分別為（13.6±1.5）%（P＜0.05）、（29.4±3.3）%（P＜0.05）。雷公藤紅素處理后HOS細胞cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和磷酸化JNK的表達水平均顯著上升。結論 雷公藤紅素或通過ROS/JNK途徑誘導人骨肉瘤細胞發(fā)生caspase依賴的凋亡。

人骨肉瘤細胞HOS；雷公藤紅素；凋亡；活性氧簇ROS

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年時期，很容易發(fā)生局部浸潤和早期全身性轉移[1]。通過手術及多種化療藥物密集療法，骨肉瘤患者的5年存活率可以達到60%。然而由于高劑量化療藥物的毒副作用明顯，限制了化療治療的發(fā)展，過去30年骨肉瘤的5年存活率一直無法提高[2]。本研究中，筆者通過研究雷公藤紅素抑制人骨肉瘤細胞系HOS的分子機制，探討雷公藤紅素抑制骨肉瘤細胞細胞活力并使其發(fā)生凋亡的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細胞系HOS購于美國ATCC（AmericanTypeCultureCollection），腫瘤細胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。

1.2 實驗試劑 RPIM-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自于Gibco公司，雷公藤紅素（celastrol）、二氫乙啶、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、SP600125（SP）、噻唑藍（MTT）、AnnexinⅤ凋亡試劑盒購自美國sigma公司。β-actin、cleavedcaspase-3（激活型caspase-3）、cleavedcaspase-9（激活型caspase-9）、p-JNK（激活型磷酸化JNK）抗體購自美國Cellsignal公司。

1.3 MTT試驗 將HOS細胞按5×103/孔接種于96孔板，分別加入1、2、3、4、5μmol/L的雷公藤紅素，對照組不加藥物，所有組別設置3個復孔。培養(yǎng)48h后加入5mg/mLMTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清，加二甲亞楓溶解細胞并顯色，震蕩使紫色絮狀物完全溶解，570nm波長下用酶標儀檢測OD值，細胞活力抑制率計算公式：抑制率=（OD對照組-OD實驗組）/ OD對照組×100%。

1.4 細胞凋亡試驗 在HOS細胞中分別加入1μmol/L、3μmol/L的雷公藤紅素，對照組不加藥物，所有組別設置3個復孔。培養(yǎng)4h后將細胞用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡試劑盒說明書步驟將Annexin-V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，細胞凋亡率用Annexin-V陽性細胞占所有細胞比值表示。

1.5 ROS（活性氧簇）檢測 在HOS細胞中分別加入1、3μmol/L的雷公藤紅素，對照組不加藥物，所有組分別設置3個復孔。培養(yǎng)48h后將細胞用生理鹽水洗滌2次，將5μM二氫乙啶加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞ROS的產生。ROS陽性細胞發(fā)射紅色熒光，因此腫瘤細胞ROS陽性率以發(fā)出紅色熒光的細胞占所有細胞比值表示[7]。

1.6 Westernblot試驗 在HOS細胞中分別加入1、3μmol/L的雷公藤紅素，對照組不加藥物。培養(yǎng)48h后將細胞用生理鹽水洗滌2次，之后將細胞裂解，將蛋白裂解液用12.5%SDSPAGE進行分離，之后通過電轉方法將蛋白質轉到PVDF膜上。將膜放入β-actin、cleavedcaspase-3、cleavedcaspase-9、p-JNK一抗稀釋液中孵育過夜，之后再用二抗稀釋液孵育2h后在X線膠片上進行曝光，之后用ImageJ圖像處理軟件進行處理，使蛋白表達灰度值用數字表示，目標蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/相應β-actin內參蛋白灰度值。

1.7 統(tǒng)計學方法 所有實驗重復3次，實驗數據用均值±SD（±s） 表示并用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行處理，采用非配對雙邊t檢驗以及單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤紅素對人骨肉瘤細胞系HOS的抑制作用 雷公藤紅素有顯著的體外抗骨肉瘤作用，不同濃度雷公藤紅素的作用下，HOS細胞活力均受到顯著抑制，雷公藤紅素對HOS細胞活力的抑制效應呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 雷公藤紅素對HOS骨肉瘤細胞的抑制作用（±s）

表1 雷公藤紅素對HOS骨肉瘤細胞的抑制作用（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與1μmol/L雷公藤紅素組比較，#P＜0.05；與2μmol/L雷公藤紅素組比較，△P＜0.05；與3μmol/L雷公藤紅素組比較，&P＜0.05；與4μmol/L雷公藤紅素組比較，○P＜0.05

2.2 雷公藤紅素誘導HOS發(fā)生caspase依賴的凋亡

3μmol/L和1μmol/L雷公藤紅素均能誘導HOS發(fā)生凋亡，同時激活caspase-8和caspase-3，當用caspase特異性抑制劑zVAD-fmk[3]抑制HOS細胞caspase的活性后，雷公藤紅素對HOS細胞的凋亡誘導效應受到抑制，表明雷公藤紅素能誘導骨肉瘤細胞發(fā)生caspase介導的凋亡，見表2。

2.3 雷公藤紅素通過ROS/JNK/caspase途徑誘導HOS細胞凋亡 高低濃度的雷公藤紅素均能顯著誘導HOS細胞ROS的產生和JNK（c-JunN-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶）的活化。當在HOS細胞培養(yǎng)體系中加入ROS清除劑NAC[4]（N-乙酰半胱氨酸）后，ROS陽性率和HOS細胞凋亡率均明顯下降（P＜0.05），JNK的活化也同時受到抑制。當在HOS培養(yǎng)體系中加入JNK特異性抑制劑SP600125[5]（SP，也稱Anthrapyrazolone）后，雷公藤紅素無法誘導細胞凋亡和JNK的活化，但對ROS的產生無影響。見表3。

3 討論

雷公藤紅素是一種從中藥雷公藤中提取的三萜類化合物，目前臨床上主要用于自身免疫性疾病和神經退行性疾病[6-7]。最近的研究發(fā)現雷公藤紅素有顯著抗腫瘤效應，如雷公藤紅素能通過線粒體-細胞色素C途徑誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡；雷公藤紅素能通過下調乳腺癌細胞MMP-9的表達，抑制乳腺癌的轉移和侵襲；雷公藤紅素還能通過激活JNK/ATF2途徑，提高順鉑對肺癌細胞的殺傷活性等[8-10]。這些結果均提示雷公藤紅素對多種類型的腫瘤都有很好的治療效果。然而雷公藤紅素抗腫瘤的其它分子機制至今仍不十分清楚，而且其對骨肉瘤是否有治療作用目前還未有過報道。本研究通過體外實驗，證實雷公藤紅素能有效抑制骨肉瘤細胞系HOS的細胞活力，并且通過激活caspase-9和caspase-3誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。

表2 雷公藤紅素對HOS細胞的凋亡誘導效應（±s）

表2 雷公藤紅素對HOS細胞的凋亡誘導效應（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與1μmol/L雷公藤紅素組比較，△P＜0.05；與3μmol/L雷公藤紅素組比較，#P＜0.05

組別對照組1μmol/L雷公藤紅素組3μmol/L雷公藤紅素組1μmol/L雷公藤紅素+zVAD-fmk組3μmol/L雷公藤紅素+zVAD-fmk組孔數雷公藤紅素濃度（μmol/L）zVAD-fmk濃度（μmol/L）33333 01313 0001 0 10灰度比（cleaved caspase-9/β-actin）0.04±0.01 0.23±0.04* 0.55±0.07* 0.10±0.03△0.16±0.04*#灰度比（cleaved caspase-3/β-actin）0.02±0.01 0.28±0.06* 0.67±0.08* 0.12±0.03*△0.21±0.06*#凋亡率（%）2.3±0.5 17.2±2.2* 39.5±3.6* 5.5±0.7△9.2±1.3*#

表3 雷公藤紅素對HOS細胞ROS/JNK通路影響（±s）

表3 雷公藤紅素對HOS細胞ROS/JNK通路影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與1μmol/L雷公藤紅素組比較，△P＜0.05；與3μmol/L雷公藤紅素組比較，#P＜0.05；NAC：N-乙酰半胱氨酸；ROS：活性氧簇

組別對照組1μmol/L雷公藤紅素組3μmol/L雷公藤紅素組1μmol/L雷公藤紅素+NAC組3μmol/L雷公藤紅素+NAC組1μmol/L雷公藤紅素+SP組3μmol/L雷公藤紅素+SP組孔數 雷公藤紅素濃度（μmol/L）NAC濃度（mmol/L）SP濃度（μmol/L）3333333 0131313 0001 0 10 00 000005 0 50 ROS陽性率（%）1.3±0.4 13.6±1.5* 29.4±3.3* 4.2±0.6△9.5±1.3*#14.5±1.6* 28.4±3.8*灰度比（p-JNK/β-actin）0.09±0.01 0.46±0.06* 0.78±0.10* 0.18±0.04△0.27±0.05*#0.14±0.03△0.19±0.05*#凋亡率（%）2.1±0.4 18.3±2.4* 42.3±4.0* 6.3±0.7*△15.4±1.6*#5.7±0.4△13.8±1.4*#

活性氧簇ROS是細胞代謝的副產物，少量的ROS有助于促進細胞的增殖和分化，然而過量的ROS能對細胞內的脂類、蛋白質和DNA造成氧化損傷[11-12]。有文獻[13]表明，相比于正常細胞，腫瘤細胞往往處于高氧化應激狀態(tài)，其對ROS濃度的升高更敏感。此外，ROS還可激活下游信號通路（如MAPK通路）誘導細胞發(fā)生凋亡。JNK是MAPK蛋白家族的重要成員，與細胞的程序性死亡有關。研究[14]表明，JNK的激活能顯著誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現雷公藤紅素能顯著誘導骨肉瘤細胞ROS的產生和JNK的活化。當用NAC清除ROS后，雷公藤紅素的凋亡誘導效應及JNK的活化作用也喪失；而當用SP阻斷JNK的磷酸化后，雷公藤紅素對HOS的凋亡誘導效應喪失，但對ROS的產生不受影響。結果證明雷公藤紅素對骨肉瘤細胞凋亡的誘導作用依賴ROS的產生和JNK的活化，而ROS是JNK的上游分子。

綜上所述，雷公藤紅素有良好的體外抗骨肉瘤作用，其分子機制可能為通過ROS/JNK途徑誘導人骨肉瘤細胞發(fā)生caspase依賴的凋亡。這些實驗結果為雷公藤紅素治療腫瘤的臨床應用提供了理論依據。

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（收稿：2015-03-26 修回：2015-04-28）

Celastrol Induces Apoptosis in Human Osteosarcoma Cell Line HOS and the Underlying M echanism

ZHUTao,ZHENG Youmao.Department of Orthopedics,Engze MedicalCenter Luqiao Hospital,Taizhou(318050),China

Objective To explore the anti-tumor effect of celastrol on human osteosarcoma（HOS）cells and the underlying mechanism.M ethods HOS cells were treated with various concentrations of celastrol,and then the cell viability was measured by using MTT assay.Apoptosis induction and ROS production were determined by flow cytometry.The expression of cleaved caspase-9,cleaved caspase-3 and phospho-JNK were evaluated by western blotting.Results The viability of HOS cells were significantly inhibited by celastrol treatment in a dose-dependent manner,and the inhibition rate was as follows:23.6%±3.5%in 1μmol/Lcelastrol group,43.7%±5.4%in 2μmol/L group,57.8%±6.9%in 3μmol/Lgroup,75.5%±6.4%in 4μmol/L group,83.7%±7.3%in 5μmol/Lgroup（all P＜0.05）. Celastrol treatment significantly induced apoptosis in HOS cells,and the apoptotic rate was significantly different between control group and 1μmol/L and 3μmol/L celastrol groups（2.3%±0.5%vs 17.2%±2.2%and 39.5%±3.6%, P＜0.05）.The ROS positive rate in HOS cells in 1μmol/L and 3μmol/L celastrol groups were significantly higher than that in control group induced（13.6%±1.5%and 29.4%±3.3%vs 1.3%±0.4%,P＜0.05）.Celastrol treatment significantly up-regulated the expression of cleaved caspase-9,cleaved caspase-3,and phospho-JNK in HOS cells. Conclusion Celastrol may induce caspase-dependent apoptotic cell death through ROS/JNKpathway in HOS cells.

human osteosarcoma（HOS）cells;celastrol;apoptosis;ROS

浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）路橋醫(yī)院骨科（溫嶺318050）

鄭有卯，Tel：15382362622