于 飛 呂金敏

血漿miR-106b表達(dá)水平對乳腺癌的診斷價值

于 飛 呂金敏

目的 探討miR-106b對乳腺癌的診斷價值。方法 熒光定量PCR檢測正常乳腺細(xì)胞系MCF-10A及乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435的miR-106b表達(dá)水平。收集30例乳腺癌患者臨床病例資料，采集患者血漿，以健康人血漿作為對照，應(yīng)用RT-PCR方法分析血漿miR-106b相對表達(dá)量與乳腺癌臨床特征的關(guān)系，評估血漿miR-106b對乳腺癌的診斷效能。結(jié)果MCF-10A細(xì)胞miR-106b相對表達(dá)量為（1.00±0.08），MCF-7細(xì)胞為（5.15±0.45），MDA-MB-231細(xì)胞為（6.86±0.57），MDA-MB-435細(xì)胞為（3.86±0.29）。乳腺癌患者血漿及健康人血漿miR-106b相對表達(dá)量分別為（4.13±2.47）和（1.00±0.75）（P＜0.05）。乳腺癌患者血漿miR-106b相對表達(dá)量與患者年齡、腫瘤大小無相關(guān)性（P＞0.05），而與腫瘤分化程度、臨床分期相關(guān)（P＜0.05）。經(jīng)ROC曲線分析，miR-106b對乳腺癌患者和健康對照者診斷乳腺癌的AUC為0.831（95%CI：0.719～0.942），敏感性和特異性分別為86.67%和76.67%。結(jié)論 乳腺癌患者血漿miR-106b異常高表達(dá)可能成為乳腺癌診斷的新靶點(diǎn)。

乳腺癌；miR-106b；血漿；診斷

乳腺癌在女性群體中是發(fā)生率最高的惡性腫瘤，在過去的20年時間里，我國乳腺癌的發(fā)生率以每年3%～4%的速度增長[1]。早期診斷和治療是提高乳腺癌治療效果的關(guān)鍵因素，因此研究、發(fā)現(xiàn)更新更好的診斷方法對乳腺癌診治有十分重大的意義。MicroRNA是近年來備受關(guān)注的一類細(xì)胞內(nèi)源性的、非編碼的小分子RNA，通過與其靶mRNA分子的3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）不完全互補(bǔ)配對，調(diào)節(jié)靶基因在轉(zhuǎn)錄后的蛋白表達(dá)水平[2]。研究發(fā)現(xiàn)血漿中一些特定的microRNA可指示腫瘤的發(fā)生[3]。本研究探討血漿miR-106b對乳腺癌診斷的潛在臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2012年9月—2014年8月本院收治的乳腺癌患者30例，均未行化療、放療或其他腫瘤相關(guān)治療，均為女性，年齡34～66歲，平均（46.2±12.5）歲，均經(jīng)病理確診。按2010年AJCC第7版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：I期10例，Ⅱ期13例，Ⅲ期7例。收集患者血漿檢測miR-106b表達(dá)水平。另收集30名健康人血漿作為對照，均為女性，年齡31～68歲，平均（44.1±15.4）歲。所有實驗步驟均取得患者知情同意。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDAMB-231、MDA-MB-435和人正常乳腺細(xì)胞系MCF-10A購于上海生科院細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)在RPIM-1640培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清，培養(yǎng)條件為37℃恒溫，并通入5%CO2。

1.3 試劑和儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血漿購于美國Gibco。Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Invitrogen。SYBR Green試劑購于日本TaKaRa。所有PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。Real Time PCR檢測儀（ABI7500）為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.4 定量PCR檢測miR-106b表達(dá) 取培養(yǎng)的細(xì)胞或500μL血漿，按試劑說明書，用500μL Trizol試劑提取總RNA。miR-106b逆轉(zhuǎn)錄采用特異性莖環(huán)引物法[4]，按試劑說明進(jìn)行miR-106b的逆轉(zhuǎn)錄。miR-106b逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGATTTCACG-3′。將該逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，用SYBR Green（TaKaRa，Japan）試劑盒進(jìn)行定量PCR，miR-106b定量PCR上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGUUUGGCAAUGGUAGAA CU-3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。將U6作為內(nèi)參。△Ct1=CT（患者血漿/健康人血漿miR-106b表達(dá)）-Ct（患者血漿/健康人血漿U6表達(dá)），△Ct2=CT（健康人血漿miR182表達(dá)）-Ct（健康人血漿U6表達(dá)），△△Ct=△Ct1-平均△Ct2，miR-106b的相對表達(dá)以2-△△CT表示[5]。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺細(xì)胞系miR-106b表達(dá) 定量PCR法檢測人正常乳腺細(xì)胞系MCF-10A及3種乳腺癌細(xì)胞系miR-106b的相對表達(dá)，結(jié)果3種乳腺癌細(xì)胞系的miR-106b表達(dá)水平均顯著高于正常乳腺細(xì)胞系（P＜0.05），見表1。

表1 乳腺癌細(xì)胞系和正常乳腺細(xì)胞系miR-106b相對表達(dá)水平比較（±s）

表1 乳腺癌細(xì)胞系和正常乳腺細(xì)胞系miR-106b相對表達(dá)水平比較（±s）

注：與MCF-10A細(xì)胞系比較，*P＜0.05

正常乳腺M(fèi)CF-10A乳腺癌MCF-7乳腺癌MDA-MB-231乳腺癌MDA-MB-435 3333 1.00±0.08 5.15±0.45* 6.86±0.57* 3.86±0.29*

2.2 乳腺癌患者血漿miR-106b表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌患者血漿及健康血漿中miR-106b相對表達(dá)量分別為（4.13±2.47）和（1.00± 0.75），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而根據(jù)患者病理報告，乳腺癌患者miR-106b的異常表達(dá)與年齡和腫瘤大小無關(guān)（P＞0.05），與臨床分期、分化程度相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 乳腺癌患者臨床指標(biāo)與miR-106b相對表達(dá)量的關(guān)系（±s）

表2 乳腺癌患者臨床指標(biāo)與miR-106b相對表達(dá)量的關(guān)系（±s）

年齡（歲） ≤45＞45≤3＞3中、低分化高分化Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ期14 16 19 11 17 13 22 8 4.01±2.12 4.45±2.98 3.75±2.69 4.87±2.31 6.87±3.89 2.89±1.41 3.12±1.58 6.34±3.45 0.63腫瘤大小（cm）0.17分化程度0.005臨床分期0.008

2.3 ROC曲線分析血漿miR-106b水平對乳腺癌篩查的價值 為了進(jìn)一步研究血漿miR-106b水平在健康人和乳腺癌患者中的差異是否有臨床價值，我們將患者/健康人血漿miR-106b Ct值與患者/健康人血漿U6 Ct值的差值（即△Ct）作為檢測指標(biāo)，用ROC曲線進(jìn)行分析。結(jié)果miR-106b對乳腺癌患者和健康對照者診斷乳腺癌的AUC為0.831（95%CI：0.719～0.942），敏感性和特異性分別為86.67%和76.67%。見圖1。

3 討 論

圖1 血漿m iR-106b水平對乳腺癌診斷的效能

microRNA是一組內(nèi)源性的，非編碼的，長度約為19～25個核苷酸的單鏈RNA，近年研究表明，microRNAs表達(dá)譜的改變和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，癌變細(xì)胞能通過改變細(xì)胞microRNA表達(dá)譜促進(jìn)致癌基因的表達(dá)和抑癌基因的沉默[6]。研究還發(fā)現(xiàn)microRNA可以作為一種新的腫瘤診斷標(biāo)志物，檢測患者血漿中特定microRNA的表達(dá)水平可有效提高惡性腫瘤的早期診斷率[6]。MiR-106b是一種致癌miRNA，研究發(fā)現(xiàn)miR-106b的高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長，而且還能通過誘導(dǎo)TGF-α信號通路促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移[7-8]。這些研究表明了miR-106b具有促腫瘤生長的作用，且在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。

本研究通過體外檢測正常乳腺細(xì)胞系和乳腺腫瘤細(xì)胞系miR-106b表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)3種乳腺腫瘤細(xì)胞系的miR-106b表達(dá)水平相比于正常乳腺細(xì)胞系均顯著增加，提示miR-106b可能在乳腺癌患者腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)。乳腺癌患者血漿中miR-106b表達(dá)水平顯著高于健康人，并且血漿miR-106b水平與乳腺癌患者腫瘤的臨床分期和分化程度有關(guān)，分化程度越低，臨床分期越高，則血漿miR-106b水平越高。這些結(jié)果說明腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移程度越高，則入血的miR-106b越高，提示檢測血漿miR-106b可能有助于乳腺癌的診斷和預(yù)后的判斷。AUC-ROC曲線分析方法判斷發(fā)現(xiàn)miR-106b曲線下面積為0.831，說明檢測血漿miR-106b水平對于乳腺癌的診斷有較高的價值。

本研究結(jié)果提示miR-106b上調(diào)可能參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程，檢測血漿miR-106b表達(dá)水平或可成為乳腺癌診斷、臨床分級與預(yù)后評估的新方法。

［1］Guarneri V，Conte P.Metastatic breast cancer：therapeutic options according tomolecular subtypes and prior adjuvant therapy［J］.Oncologist，2009，14（7）：645-656.

［2］Bartel DP.MicroRNAs：genomics,biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）：281-297.

［3］Hu A，Huang JJ，Sun GB，et al.miR-21 and miR-375 microRNAs as candidate diagnostic biomarkers in squamous cell carcinoma of the larynx:association with patient survival［J］.Am JTransl Res，2014，6（5）：604-613.

［4］Chen C，Ridzon DA，Lee DH，et al.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR［J］.Nucleic Acids Res，2005，33（20）：e179.

［5］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［6］Zhao S，Yao DS，Ding N，et al.Aberrant expression of miR-20a and miR-203 in cervical cancer［J］.Asian Pac JCancer Prev，2013，14（4）：2289-2293.

［7］Kim YK，Yu J，Kim DH，et al.Functional links between clustered microRNAs：suppression of cell-cycle inhibitors by microRNA clusters in gastric cancer［J］.Nucleic Acids Res，2009，37（5）：1672-1681.

［8］Smith AL，Iwanaga R，Tan AC，etal.ThemiR-106b-25 cluster targets Smad7，activates TGF-beta signaling，and induces EMT and tumor initiating cell characteristics downstream of Six1 in human breast cancer［J］.Oncogene，2012，31（50）：5162-5171.

（收稿：2015-03-04 修回：2015-04-12）

Clinical Significance of Plasma M iR-106b Level in Breast Cancer Diagnosis

YU Fei,LV Jinmin. Clinical Laboratory,Second AffiliatedHospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China

Objective To investigate the diagnostic value of miR-106b in patients with breast cancer.M ethods The expression of miR-106b was detected by qPCR in normal breast cell line MCF-10A and breast cancer celllines MCF-7,MDA-MB-231,and MDA-MB-435.The clinical data of 30 patients with breast cancer were collected and blood samples from these patients were drawn to detect the expression level of miR-106b by RT-PCR. Plasma from healthy people served as control.The relationship of miR-106b relative level and clinical features was analyzed and the diagnostic efficiency of miR-106b was assessed.Results The relative expression levels of miR-106b incell lines were as follows:1.00±0.08 in MCF-10A, 5.15±0.45 in MCF-7,6.86±0.57 in MDA-MB-231, and 3.86±0.29 in MDA-MB-435.The relative expression ofmiR-106bwas 1.00±0.75 in healthy controls'plasma and 4.13±2.47 in patients'plasma（P＜0.05）.In breast cancer patients,the expression of miR-106b had no significantcorrelation with age and tumor size（P＞0.05）,but exhibited distinct difference among patients at different tumor differentiation levels and TNM stage（P＜0.05）.For discriminating breast cancer patients from normal people,the areaunder the receiver operating characteristic curve for plasma miR-106b was 0.831（95%CI:0.719-0.942）,andthe sensitivity and specificity were 86.67%and 76.67%,respectively.Conclusion The abnormal expression of miR-106b maybecome a new target in the diagnosis of breast cancer.

breast cancer;miR-106b;plasma;diagnosis

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗科（杭州310005）

于飛，Tel：15958015364；E-mail：xinhuayufei@163.com