申愛平，曹帥麗，邢建新，袁俐

石河子大學醫(yī)學院病原生物學與免疫學教研室，石河子 832002

結核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)mazEF6缺失突變株的構建及其表型的初步探討

申愛平，曹帥麗，邢建新，袁俐

石河子大學醫(yī)學院病原生物學與免疫學教研室，石河子 832002

為構建結核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)mazEF6缺失突變株，并對其表型進行初步探討，首先用聚合酶鏈反應（PCR）分別從H37Rv標準株和PUC-19K質(zhì)粒擴增出mazEF6基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan；然后應用融合PCR技術將mazEF6基因的同源臂與kan基因進行雜交拼接，獲得目的融合片段，將該融合片段克隆于pMD-19T（simple）載體形成自殺質(zhì)粒pMD-19T-ΔmazEF6-kan，并將自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α中；最后利用電穿孔技術將自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至H37Rv標準株中，在卡那霉素抗性改良羅氏培養(yǎng)基上篩選H37RvΔmazEF6缺失突變株單個菌落，提取陽性菌株全基因組DNA為模板，PCR擴增克隆片段并測序。將所獲得的H37RvΔmazEF6缺失突變株進行遺傳穩(wěn)定性檢測后，對其表型進行初步研究。結果顯示，該缺失株在15代內(nèi)未發(fā)生回復性突變；與野生株相比，缺失株生長速度緩慢且細菌形態(tài)短小。本研究證實，融合PCR技術便于快速獲得結核分枝桿菌缺失突變株；結核分枝桿菌在缺失毒素-抗毒素系統(tǒng)mazEF6基因后生存能力下降，這為進一步研究毒素-抗毒素系統(tǒng)的作用奠定了基礎。

結核分枝桿菌；毒素-抗毒素系統(tǒng)；缺失突變株

結核?。╰uberculosis，TB）是一種由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的最常見的人獸共患慢性傳染病。隨著結核分枝桿菌耐藥率升高、人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）合并結核分枝桿菌感染增多，結核病在全球的流行日趨增強。

結核分枝桿菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)（toxinantitoxin system，TAS）也被稱為成癮或自殺模塊，由一個自動調(diào)節(jié)的操縱子組成，該操縱子編碼穩(wěn)定的毒素mazF和不穩(wěn)定的抗毒素mazE［1］。在應激條件下，親和性復合物中的抗毒素被降解，毒素釋放后干擾或改變細菌的代謝及生物合成，介導細菌死亡、耐藥或持留生存形成［2］，也可減慢、抑制細胞生長，甚至殺死細胞［3］。結核分枝桿菌的TAS可能與促進細菌適應不斷變化的生長速率、長期休眠和產(chǎn)生多重耐藥有關［4］，對其功能的研究有利于了解結核分枝桿菌致病機制，為開發(fā)新的抗結核藥提供新靶點。

表1 PCR引物序列Tab.1 Sequences of PCR primers

本研究通過構建結核分枝桿菌TAS mazEF6缺失突變株，并對其表型進行初步研究，為進一步揭示TAS對細菌生存能力的影響提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株結核分枝桿菌H37Rv、PUC-19K質(zhì)粒、大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α由本實驗室保存。

1.1.2 引物所用引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列見表1。

1.2 方法

1.2.1 mazEF6同源臂及卡那霉素抗性基因kan的擴增以結核分枝桿菌H37Rv基因組和PUC-19K質(zhì)粒為模板，應用高保真DNA聚合酶，擴增出mazEF6的N、C端同源臂及卡那霉素抗性基因kan。反應條件見表2。所得產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用DNA凝膠試劑盒回收，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 重疊延伸拼接-聚合酶鏈反應擴增構建體外mazEF6基因的同源重組片段將回收的mazEF6同源臂及kan基因的聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物按（N端同源臂的量）×（N端同源臂片段長度）－1∶（kan基因的量）×（kan基因片段長度）－1∶（C端同源臂的量）×（C端同源臂片段長度）－1＝1∶1∶1的比例混合，不加引物，用2×Taq PCR MasterMix進行3個片段的互補延伸，以形成全長的融合PCR產(chǎn)物（中間產(chǎn)物）。反應條件為：95℃5 min；95℃30 s，45℃3 min，72℃3 min，1個循環(huán)；72℃10 min。再以中間產(chǎn)物為模板，加入引物MazEF6-N-F、MazEF6- C-R，進行融合片段的全長擴增。反應條件為：95℃5 min；95℃30 s，51℃30 s，72℃2 min，35個循環(huán)；72℃10 min（圖1）。

表2 PCR反應條件Tab.2 The reaction conditions of PCR

圖1 T載體克隆構建結核分枝桿菌突變株的原理Fig.1 The principle of construction of M.tuberculosis mutant using T vector cloning

1.2.3 pMD-19T-ΔmazEF6-kan同源重組質(zhì)粒的構建所得同源重組片段PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收，用T4 DNA連接酶（Thermo公司）將所得克隆片段連接pMD19-T（simple）（TaKaRa公司）載體后，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α克隆菌株，在氨芐西林和卡那霉素雙抗培養(yǎng)基上篩選出陽性菌，進行菌液PCR，將能擴增出克隆片段的陽性菌株送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將測序正確的菌株擴大培養(yǎng)后，用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 結核分枝桿菌H37RvΔMazEF6缺失突變株的篩選和鑒定 取約2μl自殺質(zhì)粒，加入200μl結核分枝桿菌H37Rv感受態(tài)細胞中，混勻，冰上靜置20 min，移入1 mm電擊杯中，E＝2.5 kV／cm電擊1次，立即加入37℃預熱的2 ml 7H9培養(yǎng)基中（BD公司）。37℃搖床培養(yǎng)24 h，8 000 r／min離心3 min，吹打均勻，接種于卡那霉素抗性羅氏培養(yǎng)基（珠海貝索生物技術有限公司）。培養(yǎng)2～3周后，挑取單菌落分別接種至7H9液體培養(yǎng)基，2周后提取結核分枝桿菌全基因組DNA，分別以引物MazEF6-N-F、Kan-R，引物Kan-F、MazEF6-C-R，引物MazEF6-N-F、MazEF6-C-R，外延引物MazEF6-N′-F、MazEF6-C′-R擴增出片段N-K、KC、N-C及外延后片段N′-C′，并對PCR產(chǎn)物進行測序。將測序正確的菌株接種于改良羅氏培養(yǎng)基，傳至15代，得到穩(wěn)定的H37RvΔmazEF6缺失突變株，再次測序。以上實驗在石河子大學醫(yī)學院新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室內(nèi)完成。

1.2.5 結核分枝桿菌H37RvΔMazEF6缺失突變株生存能力的初步檢測選取在改良羅氏培養(yǎng)基上生長旺盛的結核分枝桿菌標準株H37Rv和H37Rv ΔmazEF6缺失突變菌株，接種至7H9液體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)。當細菌生長達對數(shù)期時，將細菌密度調(diào)整至1個標準麥氏單位，各取100μl菌液分別接種于10 ml 7H9液體培養(yǎng)基中［5］，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中的不同時間點（第3、6、9、12、15、18、21天）對菌液密度進行測定，同時取等量菌液進行一系列10倍稀釋后接種至改良羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3～4周，觀察菌落生長狀態(tài)，并對各時間點的菌株進行結核分枝桿菌抗酸染色，觀察野生株與突變株在顯微鏡下的形態(tài)差異。

2 結果

2.1 mazEF6同源臂和卡那霉素抗性基因kan的擴增及鑒定

以結核分枝桿菌H37Rv標準株為模板擴增出mazEF6的N端同源臂條帶大小為538 bp，擴增出mazEF6的C端同源臂條帶大小為479 bp（圖2），以PUC-19K質(zhì)粒為模板擴增出kan基因條帶大小為1 093 bp（圖3），目的條帶大小均與預期一致。

圖2 MazEF-6同源臂PCR擴增Fig.2 PCR amplification of MazEF6 homologous arm

圖3 kan基因的擴增片段Fig.3 PCR amplification of kangene

2.2 pMD-19T-ΔmazEF6-kan同源重組質(zhì)粒的鑒定

由于pMD19-T（simple）載體本身含氨芐西林抗性，克隆片段具有卡那霉素抗性，故構建成功的自殺質(zhì)?？稍诤邪逼S西林和卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上生長。以陽性菌的質(zhì)粒為模板，用引物MazEF6-N-F和MazEF6-C-R擴增出的同源重組片段大小為2 110 bp，結果與預期一致（圖4、5）。

圖4 構建成功的同源重組質(zhì)粒Fig.4 Construction of homologous recombination plasmid

2.3 結核分枝桿菌H37RvΔMazEF6缺失突變株的篩選

挑取電轉(zhuǎn)后在卡那霉素抗性培養(yǎng)基中生長的結核分枝桿菌單個菌落，提取全基因組DNA為模板，分別以引物MazEF6-N-F、Kan-R，引物Kan-F、MazEF6-C-R，引物MazEF6-N-F、MazEF6-C-R，外延引物MazEF6-N′-F、MazEF6-C′-R擴增出的N-K條帶大小為1 631 bp，K-C條帶大小為1 572 bp，NC條帶大小為2 110 bp，外延后N′-C′條帶大小為2 517 bp（圖6）。目的條帶大小均與預期一致，證明成功獲得結核分枝桿菌H37RvΔmazEF6缺失突變株。

圖5 同源重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.5 Identification of homologous recombination plasmid

圖6 以缺失株為模板擴增出的N-K、K-C、N-C、N′-C′片段Fig.6 Amplification of N-K，K-C，N-C and N′-C′fragments with deletion mutant as a template

2.4 結核分枝桿菌H37RvΔMazEF6缺失突變株的遺傳穩(wěn)定性檢測

將所獲得的基因缺失株送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，所得結果與克隆片段基因比對同源度為100%，傳至第15代，再次測序，未發(fā)生回復性突變，成功獲得具有遺傳穩(wěn)定性的H37Rv ΔmazEF6缺失株。

2.5 結核分枝桿菌H37RvΔMazEF6缺失突變株的生長情況

在改良羅氏培養(yǎng)基上，H37Rv和H37Rv ΔmazEF6缺失突變菌株均為淡黃色菌落，呈菜花樣生長。H37Rv和H37RvΔmazEF6缺失突變菌株在各時間點的抗酸染色顯示，與野生株相比，突變株形態(tài)較短?。▓D7）。觀察比較不同時間點H37Rv與H37RvΔmazEF6缺失突變菌株的活菌數(shù)，結果顯示，在培養(yǎng)第3、6、9和12天，H37Rv與H37Rv ΔmazEF6缺失突變菌株的活菌數(shù)不同，但差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在培養(yǎng)的第15、18和21天，H37Rv菌株的活菌數(shù)顯著高于H37Rv ΔmazEF6缺失突變菌株，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖8）。

圖7 H37Rv和H37RvΔmazEF6對數(shù)期染色圖片F(xiàn)ig.7 H37Rv and H37RvΔmazEF6in the logarithmic phase

圖8 不同培養(yǎng)時間點結核分枝桿菌的活菌數(shù)（Log10／ml）Fig.8 The counts of live bacteria at different culture time points

3 討論

結核病是一種由結核分枝桿菌引起的慢性感染性疾病，嚴重威脅人類健康，其致死率在感染性疾病中位于第2，僅次于HIV感染。結核分枝桿菌可引起潛伏感染，發(fā)病前細菌可持留生存多年。結核分枝桿菌的持留性［6］，即于逆境下能保持穩(wěn)定和對環(huán)境適應的特性，對結核分枝桿菌潛伏感染及結核病病程的遷延和復發(fā)起著重要作用。分枝桿菌中存在大量TAS模塊。在結核分枝桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)88個假定的TAS，其中30個已被確認具有TAS的功能［7］。在結核分枝桿菌已確定的9個mazF同系物中，有7個在大腸埃希菌中表達時會造成生長停滯［8］。

未知基因功能的研究得力于突變株的構建，因此快速、高效地構建基因突變株可大大提高基因功能研究的效率?；蛑丿B延伸拼接-PCR（splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR）法構建自殺質(zhì)粒是利用基因搭橋法快速獲得目的融合片段（即基因克隆片段），在一定程度上避免了雙酶切法的繁瑣性。同時，應用抗性基因替換構建基因缺失菌株，不僅減少了質(zhì)粒整合帶來的問題，還提供了一個篩選標記，能通過一次篩選即可得到突變株［9］?；谝陨戏椒?，本課題組成功構建了自殺質(zhì)粒pMD-19T-ΔmazEF6-kan，并利用電穿孔技術成功構建了結核分枝桿菌mazEF6缺失突變株，為結核分枝桿菌突變株的構建提供了快速、有效的方法，也為進一步揭示mazEF6的生物學作用奠定了基礎。

TAS在細菌內(nèi)的相互作用可介導應激誘發(fā)的非復制狀態(tài)［10］。張俊杰等研究表明，毒素蛋白Rv1991c（MazF6）、Rv2801c（MazF9）和Rv1102c（MazF3）通過切割RNA發(fā)揮抑菌或殺菌活性；且Rv1991a-1991c（MazEF6）和Rv2801a-2801c（MazEF9）系統(tǒng)可能參與結核分枝桿菌在營養(yǎng)匱乏條件下的生長調(diào)控［11］。結核分枝桿菌對Rv1991c（MazF6）的表達非常敏感，即使在非常低的水平也能顯著降低細菌存活率［12］。本研究通過在不同培養(yǎng)時間點分別對H37Rv和H37RvΔmazEF6缺失突變菌株進行計數(shù)和結核分枝桿菌抗酸染色，比較缺失株與野生株在表型上的差異。結果發(fā)現(xiàn)，H37RvΔmazEF6缺失突變菌株不但生長速度較慢，而且在顯微鏡下的形態(tài)也較野生株短小，推測結核分枝桿菌較強的生存能力可能與TAS相關。

關于TAS的功能，Zorzini等提出了不同的觀點：①自私的基因；②可保護特定染色體片段的穩(wěn)定性；③在細菌應激反應和持留形成過程中發(fā)揮作用［13］。結核分枝桿菌較強的生存能力可能與TAS相關，但該系統(tǒng)在結核分枝桿菌中的作用機制尚不清楚，有待進一步研究。

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Construction and characterization of toxin-antitoxin system mazEF6 deletion in Mycobacterium tuberculosis

SHEN Ai-Ping，CAO Shuai-Li，XING Jian-Xin，YUAN Li
Department of Pathogenic Biology and Immunology，School of Medicine，Shihezi University，Shihezi 832002，China

To study the toxin-antitoxin system mazEF6 of Mycobacterium tuberculosis（M.tuberculosis），deletion mutants were constructed and subjected to phenotype analysis.First，the flanking（homology arms）of mazEF6 gene from H37Rv and kanamycin resistance gene（kan gene）from plasmid PUC-19K were amplified by polymerase chain reaction（PCR）respectively.Second，fusion PCR was used for the hybrid splicing of mazEF6 homology arms and kan gene，and the desired fusion fragment was obtained.Then the fragment was cloned into pMD-19T（simple）vector to form a suicide plasmid（pMD-19T-ΔmazEF6-kan），and the suicide plasmid was transformed into Escherichia coli（E.coli）DH5α.At last，the constructed plasmid was transformed into H37Rv by electroporation.Single colonies of M.tuberculosis were screened on L-J medium with kanamycin，the genomic DNA of positive strains were extracted，and the targeted fragments were amplified by PCR and sequenced.The genetic stability and other phenotypes of the H37Rv ΔmazEF6 deletion mutant were studied.The results showed that the deletion mutant strains did not presentreverse mutant within 15 generations.Compared with the wild-type strains，H37RvΔmazEF6 deletion mutant strains grew more slowly and the bacterial cell was relatively shorter.This study demonstrated that it is practical to obtain M.tuberculosis deletion mutant by fusion PCR technology，and the survival ability ofM.tuberculosiswithout toxin-antitoxin mazEF6 gene is decreased.

Mycobacterium tuberculosis；Toxin-antitoxin system；Deletion mutant strain

.YUAN Li，E-mail：yuanli832000＠sina.com

2014-04-08）

國家自然科學基金（81160368、81341079）

袁俐