魏建春，崔曉云，吳娜，安靜

首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系微生物學(xué)教研室，北京 100069

抗Ⅱ型登革病毒蛋白抗體的制備和特點(diǎn)分析

魏建春，崔曉云，吳娜，安靜

首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系微生物學(xué)教研室，北京 100069

本研究旨在制備和鑒定小鼠抗Ⅱ型登革病毒（DENV-2）10種蛋白的抗體，為后續(xù)相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)材料。利用真核表達(dá)載體pReceiver構(gòu)建DENV-2 10種蛋白的重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒DNA，肌內(nèi)注射免疫小鼠，共免疫4次。末次免疫后2周取小鼠血清，利用DENV-2感染的Vero細(xì)胞和DENV-2各蛋白的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、間接免疫熒光法（IFA）和蛋白免疫印跡法評(píng)價(jià)免疫效果，分析抗體的特點(diǎn)。DNA免疫小鼠后獲得抗DENV-2 10種蛋白的抗血清，抗體效價(jià)波動(dòng)于1∶400～1∶16 127之間，以抗E蛋白抗體效價(jià)最高，達(dá)1∶16 127，而抗NS3、NS4b、NS5蛋白抗體效價(jià)較低，僅為1∶400。利用DENV-2感染的Vero細(xì)胞和穩(wěn)定表達(dá)病毒蛋白的EAhy926細(xì)胞進(jìn)行IFA染色，抗DENV-2各蛋白的抗血清均可特異性識(shí)別DENV-2抗原。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，抗E、NS1、NS4b和NS5蛋白抗體能識(shí)別熱變性蛋白，其他抗血清未呈現(xiàn)陽性反應(yīng)條帶。本研究提示，DNA免疫小鼠所獲得的抗DENV-2各蛋白抗體能特異性識(shí)別自然感染或模擬自然感染狀態(tài)下的DENV-2蛋白，可為后續(xù)相關(guān)研究提供工具，也表明DNA免疫法可作為抗體制備的一種策略。

登革病毒；結(jié)構(gòu)蛋白；非結(jié)構(gòu)蛋白；抗體；EAhy926細(xì)胞

Key words：Dengue virus；Structural protein；Non-structural protein；Antibody；EAhy926 cell

登革病毒（dengue virus，DENV）是黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）單股正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)度約11 kb，編碼10種蛋白，包括3種結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白（capsid，C）、膜蛋白（membrane，M）和包膜蛋白（envelope，E），以及7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4、NS5）。DENV有4種血清型，即DENV-1～DENV-4［1－3］。DENV主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊進(jìn)行傳播，感染后可引起臨床表現(xiàn)較為輕微的登革熱（dengue fever，DF）或（和）威脅生命的重癥登革熱﹝如登革出血熱（dengue hemorrhagic fever，DHF）和登革休克綜合征（dengue shock syndrome，DSS）﹞［4－6］。自1780年美國(guó)費(fèi)城首次報(bào)道登革熱流行以來，DENV感染人數(shù)逐年上升。南亞、東南亞和美洲等熱帶和亞熱帶地區(qū)為主要流行區(qū)域［7－9］。據(jù)2013年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）統(tǒng)計(jì)，全球DENV感染人數(shù)約為3億9千萬，是2009年的3倍［6］。特別值得一提的是，2014年我國(guó)廣東省也出現(xiàn)了歷史上最嚴(yán)重的登革熱疫情，有4萬余病例，且有較多重癥病例。由此可見，登革熱已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

目前，針對(duì)登革熱仍沒有疫苗及有效的抗病毒藥物問世，僅憑媒介控制來預(yù)防疾病擴(kuò)散收效有限，且成本較高。關(guān)于DENV的研究也存在許多空白點(diǎn)。已知NS3是病毒復(fù)制的關(guān)鍵因子，因此其成為研究抗DENV藥物的靶點(diǎn)。其他病毒蛋白特別是非結(jié)構(gòu)蛋白可能與病毒復(fù)制有關(guān)，但確切功能尚未完全闡明，主要原因之一是缺少必要的研究工具，特別是缺少理想的抗DENV蛋白抗體。本研究利用DNA免疫，制備了針對(duì)DENV-2 10種蛋白的抗體，并通過DENV-2感染的細(xì)胞核建立了穩(wěn)定表達(dá)病毒蛋白的細(xì)胞株，證明所獲抗體能特異性識(shí)別自然感染或模擬自然感染狀態(tài)下的DENV-2蛋白，為深入研究DENV的復(fù)制機(jī)制提供了研究工具，也為進(jìn)一步探索DENV的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒株和動(dòng)物白紋伊蚊細(xì)胞C6／36：常規(guī)使用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，28℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。C6／36細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。非洲綠猴腎細(xì)胞Vero：常規(guī)使用含5%小牛血清的MEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。血管內(nèi)皮細(xì)胞EAhy926：常規(guī)使用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。EAhy926細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。DENV-2：TR1751株分離自登革熱患者血清，由本實(shí)驗(yàn)室保存。病毒經(jīng)C6／36細(xì)胞增殖，測(cè)定滴度后－80℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)動(dòng)物：無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)6周齡BALB／c雌性小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 質(zhì)粒和主要試劑真核表達(dá)載體pRceiver為本實(shí)驗(yàn)室保存。以此為載體，將表達(dá)DENV-2 10種蛋白的重組質(zhì)粒分別命名為pReceiver-C、pReceiver-M、pReceiver-E、pReceiver-NS1、pReceiver-NS2a、pReceiver-NS2b、pReceiver-NS3、pReceiver-NS4a、pReceiver-NS4b和pReceiver-NS5，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。無內(nèi)毒素超純質(zhì)粒提取試劑盒購自美國(guó)Omega公司。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國(guó)Invitrogen公司，篩選抗生素G418購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、吐溫20、多聚甲醛、RIPA裂解液（配PMSF）購自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，Triton X-100、CY3標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自美國(guó)Sigma公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自美國(guó)KPL公司，24及96孔板購自美國(guó)Corning公司，培養(yǎng)基MEN、DMEM和RPMI 1640購自美國(guó)Gibco公司，新生牛血清和胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司，氨芐西林購自華北制藥股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗DENV-2 10種蛋白抗體的制備與鑒定質(zhì)粒提?。簩Receiver-C、pReceiver-M、pReceiver-E、pReceiver-NS1、pReceiver-NS2a、pReceiver-NS2b、pReceiver-NS3、pReceiver-NS4a、pReceiver-NS4b和pReceiver-NS5質(zhì)粒菌液按1∶100分別轉(zhuǎn)接到含有氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r／min震蕩過夜。次日用無內(nèi)毒素超純質(zhì)粒提取試劑盒，按說明書進(jìn)行操作，提取質(zhì)粒DNA，然后用無菌生理鹽水將其稀釋至250 ng／μl。4℃、12 000 r／min離心20 min，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

每種質(zhì)粒DNA免疫3只小鼠，步驟如下：小鼠大腿常規(guī)消毒，每只小鼠肌內(nèi)注射質(zhì)粒DNA25 μg。間隔2周以相同劑量加強(qiáng)免疫1次，共免疫4次。末次免疫后2周，小鼠眼眶靜脈叢取血，分離血清。分裝后－80℃保存，待測(cè)抗體效價(jià)波動(dòng)于1∶400～1∶16 127之間。抗E蛋白抗體最高，達(dá)1∶16 127；抗NS3、NS4b、NS5蛋白抗體較低，僅為1∶400（表1）。

表1 利用表達(dá)DENV-2蛋白的質(zhì)粒DNA免疫小鼠后各抗體的終點(diǎn)效價(jià)（n＝3）Tab.1 Antibody titers in serum of BALB／c mice immunized with different recombinant plasmids expressing DENV-2 proteins（n＝3）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)抗體效價(jià)，主要包括以下步驟。①包被抗原：利用包被緩沖液稀釋DENV-2全蛋白，以2μg／孔（100μl）進(jìn)行包被，4℃孵育過夜。②封閉：PBS洗3次，每次5 min，然后加入含1%牛血清白蛋白的PBS（bovine serum albumin／PBS，BSA／PBS）（100μl／孔），室溫孵育2 h，以阻斷抗體的非特異結(jié)合。③孵育一抗：PBS洗3次，每次5 min，以小鼠DNA免疫血清為一抗，用0.1%BSA／PBS稀釋，稀釋度依次為1∶100、1∶200、1∶400、1∶800……每孔加入100μl，4℃孵育過夜。設(shè)空白對(duì)照（PBS）、陰性對(duì)照（正常小鼠血清）。④孵育二抗：PBS洗3次，每次5 min。加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG（100μl／孔），37℃孵育1 h。⑤顯色：PBS洗3次，每次5 min，加入新鮮配制的底物顯色液（100μl／孔），37℃孵育20 min。待顏色穩(wěn)定后，加入2 mol／L H2SO4終止反應(yīng)（50μl／孔）。⑥讀數(shù)：立即置酶標(biāo)儀測(cè)定光密度（optical density，OD）（492 nm），檢測(cè)孔OD值大于陰性對(duì)照孔的2.1倍判為陽性，確定最高稀釋度的陽性孔為抗體效價(jià)。

間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）鑒定抗體，主要步驟如下。①細(xì)胞傳代：將Vero細(xì)胞傳代至24孔板，次日接種DENV-2﹝感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為1﹞，感染1 h后棄去病毒液，加入維持培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。陰性對(duì)照不接種病毒。②固定：收集24孔板，PBS漂洗細(xì)胞3次，每次5 min。每孔加入4%多聚甲醛200 μl，室溫放置30 min。③打孔：PBS漂洗細(xì)胞3次，每次5 min，加入0.2%Triton X-100／PBS（200μl／孔），室溫放置10 min。④封閉：PBS漂洗細(xì)胞3次，每次5 min，加入1%BSA／PBS（200μl／孔），室溫放置1 h。⑤孵育一抗：PBS漂洗細(xì)胞3次，每次5 min。以小鼠DNA免疫血清為一抗，用0.1% BSA／PBS按1∶100進(jìn)行稀釋，每孔加入200μl，4℃孵育過夜。⑥孵育二抗：PBS漂洗細(xì)胞3次，每次5 min。用0.1%BSA／PBS按1∶1 000將CY3標(biāo)記羊抗小鼠IgG進(jìn)行稀釋，每孔加入200μl，37℃避光孵育1 h。⑦觀察：PBS漂洗細(xì)胞3次，每次5 min。置熒光顯微鏡下觀察。

蛋白免疫印跡法鑒定抗體：收集正常Vero細(xì)胞及DENV-2（MOI＝1）感染24 h后的Vero細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液制備蛋白樣本，分別作為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。進(jìn)行12%（檢測(cè)GAPDH、E、NS1、NS3及NS5）和15%（檢測(cè)C、M、NS2a、NS2b、NS4a及NS4b）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），凝膠經(jīng)300 mA恒流轉(zhuǎn)印3 h于聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2～3 h，然后以小鼠DNA免疫血清為一抗（1∶200，5%脫脂奶粉稀釋），4℃孵育過夜；用含吐溫20的Tris緩沖液（Tris buffered saline with Tween-20，TBST）洗膜3次，每次10 min；加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG，37℃孵育1 h；TBST洗膜3次，每次10 min，暗室曝光。

1.2.2 DENV-2 10種蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立

細(xì)胞株篩選：提取重組質(zhì)粒和表達(dá)載體pReceiver的DNA，將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EAhy926細(xì)胞。按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。簡(jiǎn)要步驟如下：6孔板內(nèi)接種EAhy926細(xì)胞，培養(yǎng)24 h使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將OPTI-MEM與4.0μg質(zhì)粒稀釋至50μl，混勻后室溫靜置5 min。取3μl脂質(zhì)體用OPTI-MEM稀釋至50μl，混勻后室溫靜置5 min。將兩者混勻，室溫靜置20 min。棄除EAhy926細(xì)胞中的培養(yǎng)基，用PBS反復(fù)洗3次，每孔加入1 ml OPTI-MEM。將6孔板第1個(gè)孔設(shè)為對(duì)照孔，其余5個(gè)孔平均加入100μl質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合液，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。4 h后棄除OPTI-MEM培養(yǎng)基，加入新的OPTI-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；吸棄6孔板內(nèi)液體，更換為選擇培養(yǎng)基（15%DMEM，含G418 400 ng／ml）進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)照孔細(xì)胞全部死亡后，選擇培養(yǎng)基的濃度降至200 ng／ml。待細(xì)胞長(zhǎng)滿，將其轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)行鑒定。

細(xì)胞株鑒定：細(xì)胞株篩選完成后，用IFA對(duì)其進(jìn)行鑒定。一抗為上述DNA免疫所獲多克隆抗體，稀釋度為1∶100。二抗為CY3標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，稀釋度為1∶1 000。方法同上。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)抗DENV-2 10種蛋白抗體的水平

圖1 抗DENV-2各蛋白抗體與Vero細(xì)胞中病毒抗原的特異性反應(yīng)Fig.1 Antibodies against DENV-2 proteins specially responding to viral antigens in infected Vero cells

利用表達(dá)DENV-2 10種蛋白的重組質(zhì)粒免疫小鼠后，分離血清，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常小鼠血清（陰性對(duì)照組）僅有很低的非特異背景，其余免疫小鼠血清均可檢測(cè)到不同水平的抗體效價(jià)，效價(jià)波動(dòng)于1∶400～16 127之間。其中注射重組質(zhì)粒pReceiver-E、pReceiver-NS1組抗體效價(jià)較高，分別達(dá)1∶16 127和1∶10 159，而注射重組質(zhì)粒pReceiver-NS3、pReceiver-NS4b、pReceiver-NS5組DNA免疫效價(jià)較低，為1∶400。表明病毒蛋白E和NS1具有較好的免疫原性，可獲得較好的免疫效果，與全病毒顆粒免疫獲得針對(duì)DENV-2的多克隆抗體效價(jià)相當(dāng)（表1）。

2.2 IFA和蛋白免疫印跡法檢測(cè)抗DENV-2 10種蛋白抗體對(duì)病毒抗原的識(shí)別

用IFA檢測(cè)抗DENV-2 10種蛋白抗體對(duì)自然感染病毒抗原的識(shí)別情況，以上述重組質(zhì)粒DNA免疫小鼠血清為一抗，DENV-2感染的Vero細(xì)胞為抗原進(jìn)行IFA染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗DENV-2 10種蛋白的抗體均可識(shí)別相應(yīng)的病毒抗原，特異性免疫熒光分布在細(xì)胞質(zhì)，與ELISA結(jié)果一致。以抗E、NS1蛋白抗體染色最強(qiáng)，其他抗體染色強(qiáng)度略弱，但也能清晰顯示。陰性對(duì)照組未見特異性熒光。結(jié)果提示，本研究所制備的抗體可識(shí)別自然感染的DENV-2抗原（圖1）。

收集DENV-2感染前后的Vero細(xì)胞蛋白，用蛋白免疫印跡法鑒定病毒抗體與熱變性蛋白的反應(yīng)情況。結(jié)果顯示，陽性對(duì)照血清（即全病毒顆粒免疫小鼠血清）及E、NS1、NS4b和NS5的抗血清能識(shí)別變性后的相應(yīng)蛋白，其余幾種病毒蛋白的抗血清未能檢測(cè)到特異反應(yīng)（圖2）。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)抗DENV-2各蛋白抗體與感染細(xì)胞中病毒抗原的反應(yīng)Fig.2 The reaction of antibodies against viral proteins analyzed by Western blotting

圖3 抗DENV-2各蛋白抗體特異性識(shí)別質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EAhy926細(xì)胞中的病毒抗原Fig.3 Antibodies against DENV-2 proteins specially responding to viral antigens in transfected EAhy926 cells

2.3 利用DENV-2各蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株鑒定抗體

通過脂質(zhì)體法，用載體pReceiver及DENV-2 10種蛋白的重組質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞樣細(xì)胞株EAhy926，G418篩選成功后，以DNA免疫小鼠所獲抗體為一抗，進(jìn)行IFA染色。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染DENV-2各蛋白的細(xì)胞中均可檢測(cè)到特異性免疫熒光反應(yīng)，而轉(zhuǎn)染載體pReceiver的細(xì)胞中未見特異性免疫熒光反應(yīng)（圖3）。

3 討論

近年來，隨著全球暖化、旅游業(yè)發(fā)展和人口流動(dòng)性增加，登革熱的發(fā)病率呈明顯增加趨勢(shì)，流行區(qū)域也在不斷擴(kuò)大，存在著從一種輸入性傳染病轉(zhuǎn)變?yōu)榈胤叫詡魅静〉目赡堋HO發(fā)布報(bào)告，強(qiáng)調(diào)登革熱已成為世界上疾病增長(zhǎng)負(fù)擔(dān)最快的病種之一［7，10，11］。盡管如此，目前仍沒有美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的登革熱疫苗和有效的抗病毒措施用于預(yù)防和治療。同時(shí)，缺少理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和必要的研究工具，特別是無商品化的抗DENV蛋白抗體，也不同程度地妨礙了DENV復(fù)制機(jī)制、致病機(jī)制及疫苗等的研究。已知DENV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒的復(fù)制和致病過程，如NS3具有蛋白酶、RNA解螺旋酶和RNA聚合酶活性，在病毒復(fù)制和成熟過程中起作用；NS5有RNA聚合酶活性和甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可能參與RNA帽的形成［3，12－16］。但大多數(shù)DENV蛋白的確切功能尚不十分清楚。為此，本研究利用表達(dá)DENV-2結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白的10種重組質(zhì)粒DNA免疫小鼠，獲得相應(yīng)的多克隆抗體，用ELISA和IFA等證明所獲抗體可識(shí)別自然感染或模擬自然感染狀態(tài)下的DENV抗原，為深入研究登革熱發(fā)病機(jī)制提供了有效的工具和手段。

DNA免疫是近年來發(fā)展起來的免疫策略，其優(yōu)點(diǎn)如下：目的抗原在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)，可在體內(nèi)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)；DNA免疫成本較低，便于操作；與蛋白免疫相比，省去了蛋白純化等繁瑣步驟；隨著佐劑和免疫方法的改進(jìn)，DNA免疫效果得到進(jìn)一步提升［17－20］。結(jié)合本次DNA免疫小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗E、NS1蛋白抗體效價(jià)較高，達(dá)1∶10 000以上，而其余幾種抗體效價(jià)波動(dòng)于1∶400～1∶800之間。其原因可能是不同蛋白的免疫原性不同，pRe-ceiver-E和pReceiver-NS1免疫原性較強(qiáng)，而其余幾種重組質(zhì)粒免疫原性較弱。除抗E、NS1蛋白抗體外，其他病毒蛋白的抗體效價(jià)不高，但進(jìn)行IFA時(shí)背景低，干擾小，所有抗體均能特異性識(shí)別病毒抗原，表明該抗體有實(shí)用價(jià)值。尤其值得一提的是，制備大分子蛋白的抗體可用純化蛋白免疫動(dòng)物來獲得。但對(duì)于難以獲得的小分子抗原，其抗體制備存在一定困難。本研究結(jié)果提示，DNA免疫方法不僅適用于DENV蛋白抗體的制備，還適用于其他小分子抗原抗體的制備。

利用DENV-2各蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株鑒定抗DENV-2 10種蛋白抗體時(shí)，在相同實(shí)驗(yàn)條件及改良實(shí)驗(yàn)條件下，EAhy－pReceiver-4a和EAhy－pReceiver-4b細(xì)胞株始終不能成功建立。這可能是因?yàn)镹S4a和NS4b有細(xì)胞毒性，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成干擾，提示NS4a和NS4b可能參與病毒致病過程，是今后研究中值得關(guān)注的靶點(diǎn)。

另外，利用蛋白免疫印跡法檢測(cè)所制備抗體時(shí)，仍有幾種病毒蛋白的免疫血清未能識(shí)別相應(yīng)蛋白，且反復(fù)實(shí)驗(yàn)效果均不理想。推測(cè)其原因可能有2個(gè)：一是質(zhì)粒DNA免疫所獲抗體只識(shí)別目的蛋白空間立體結(jié)構(gòu)，在蛋白經(jīng)加熱變性成為線性結(jié)構(gòu)后，并不能很好地被抗體識(shí)別；二是各病毒蛋白在細(xì)胞感染后表達(dá)量多少不一，其中E蛋白和NS1蛋白表達(dá)量較豐富，提示用該法制備DENV-2各蛋白抗體有局限性。

綜上所述，本研究利用重組質(zhì)粒對(duì)小鼠進(jìn)行DNA免疫，獲得了抗DENV-2各蛋白的特異性抗體。這類抗體能特異性識(shí)別自然感染或模擬自然感染狀態(tài)下的DENV-2蛋白，為后續(xù)相關(guān)研究提供了工具，還提示DNA免疫方法可作為難以獲得的小分子蛋白抗體制備的一種策略。

［1］ Guzman MG，Harris E.Dengue［J］.Lancet，2015，385（9966）：453-465.

［2］ Guzman MG，Halstead SB，Artsob H，Buchy P，F(xiàn)arrar J，Gubler DJ，Hunsperger E，Kroeger A，Margolis HS，Martínez E，Nathan MB，Pelegrino JL，Simmons C，Yoksan S，Peeling RW.Dengue：a continuing global threat［J］.Nat Rev Microbiol，2010，8（12 Suppl）：S7-S16.

［3］ Rothman AL.Immunity to dengue virus：a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms［J］.Nat Rev Immunol，2011，11（8）：532－543.

［4］ B?ck AT，Lundkvist A.Dengue viruses—an overview［J／OL］.Infect Ecol Epidemiol，2013，3：10.3402／iee.v3i0.19839.http：／／www.infectionecologyandepidemiology.net／index.php／iee／article／view／19839.

［5］ Halstead SB.Controversies in dengue pathogenesis［J］.Paediatr Int Child Health，2012，32（Suppl 1）：5-9.

［6］ Normile D.Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control efforts［J］.Science，2013.342：415.

［7］ Rodriguez-Roche R，Gould EA.Understanding the dengue viruses and progress towards their control［J／OL］.Biomed Res Int，2013，2013：690835.http：／／dx.doi.org／10.1155／2013／690835.

［8］ Bhatt S，Gething PW，Brady OJ，Messina JP，F(xiàn)arlow AW，Moyes CL，Drake JM，Brownstein JS，Hoen AG，Sankoh O，Myers MF，George DB，Jaenisch T，Wint GR，Simmons CP，Scott TW，F(xiàn)arrar JJ，Hay SI.The global distribution and burden of dengue［J］.Nature，2013，496（7446）：504-507.

［9］ Thomas SJ，Endy TP.Critical issues in dengue vaccine development［J］.Curr Opin Infect Dis，2011，24（5）：442-450.

［10］ Halstead SB.Dengue［J］.Lancet，2007，370（9599）：1644-1652.

［11］ Gubler DJ.Epidemic dengue／dengue hemorrhagic fever as a public health，social and economic problem in the 21st century［J］.Trends Microbiol，2002，10（2）：100-103.

［12］ Modis Y，Ogata S，Clements D，Harrison SC.Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion［J］.Nature，2004，427（6972）：313－319.

［13］ Mukhopadhyay S，Kuhn RJ，Rossmann MG.A structural perspective of the flavivirus life cycle［J］.Nat Rev Microbi-ol，2005，3（1）：13-22.

［14］ Wang PG，Kudelko M，Lo J，Siu LY，Kwok KT，Sachse M，Nicholls JM，Bruzzone R，Altmeyer RM，Nal B.Efficient assembly and secretion of recombinant subviral particles of the four dengue serotypes using native prM and E proteins［J］.PLoS One，2009，4（12）：e8325.

［15］ Valdés K，Alvarez M，Pupo M，Vázquez S，Rodríguez R，Guzmán MG.Human dengue antibodies against structural and nonstructural proteins［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2000，7（5）：856-857.

［16］ Churdboonchart V，Bhamarapravati N，Peampramprecha S，Sirinavin S.Antibodies against dengue viral proteins in primary and secondary dengue hemorrhagic fever［J］.Am J Trop Med Hyg，1991，44（5）：481-493.

［17］ Sardesai NY，Weiner DB.Electroporation delivery of DNA vaccines：prospects for success［J］.Curr Opin Immunol，2011，23（3）：421-429.

［18］ Beckett CG，Tjaden J，Burgess T，Danko JR，Tamminga C，Simmons M，Wu SJ，Sun P，Kochel T，Raviprakash K，Hayes CG，Porter KR.Evaluation of a prototype dengue-1 DNA vaccine in a phase 1 clinical trial［J］.Vaccine，2011，29（5）：960-968.

［19］ Weiner DB，Sardesai NY，Schmaljohn C.Introduction to DNA vaccines—Las Vegas［J］.Vaccine，2010，28（8）：1893-1896.

［20］ Wei J，Chen H，An J.Recent progress in dengue vaccine development［J］.Virol Sin，2014，29（6）：353－363.

Preparation and characteristic analysis of anti-dengue virus serotype 2 antibodies

WEI Jian-Chun，CUI Xiao-Yun，WU Na，AN Jing
Department of Microbiology，School of Basic Medical Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069，China

Eukaryotic expression vector containing different proteins（C，M，E and NS1-5）of dengue virus serotype 2（DENV-2）were constructed and intramuscularly injected directly to mice for developing antibodies against DENV-2.Two weeks after the fourth immunization，sera were collected and the immune effects were evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA），indirect immunofluorescence assay（IFA）and Western blotting.Specific antibodies could be obtained by DNA immunization，and the titers of these antibodies fluctuated between 1∶400-1∶16 127.Of those，the antibody against protein E showed the highest titer at 1∶16 127 whereas the antibodies against proteins NS3，NS4b and NS5 had the lowest titer at 1∶400.The results showed that all antibodies acquired by DNA immunization could produce specific immunofluorescent reactions when tested using DENV-2-infected Vero cells，suggesting that antibodies prepared by DNA immunization could specifically identify naturally infected DENV-2.Antibodies against proteins E，NS1，NS4b and NS5 could also identify heat-denatured proteins.The results generated from this study provided the base for further research.

.AN Jing，E-mail：anjing＠ccmu.edu.cn

2015-02-02）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81301435、81401676、81471957）

安靜