華亦斐，王晴嵐，牛辰，高謙

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部／衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

mkl基因在海分枝桿菌抵抗宿主免疫中的作用

華亦斐，王晴嵐，牛辰，高謙

復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部／衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

本研究利用MycoMarT7噬菌體建立了海分枝桿菌隨機(jī)突變庫，鑒定獲得1株轉(zhuǎn)座子插在基因MMAR＿0994（mkl）上的突變株。用野生株和突變株分別感染斑馬魚成魚，通過觀察斑馬魚的存活情況，研究mkl基因?qū)７种U菌毒力的影響；利用尾靜脈注射感染孵出48 h后的斑馬魚幼魚，于熒光顯微鏡下觀察突變株及野生株在幼魚體內(nèi)的播散情況，以檢測(cè)mkl基因在細(xì)菌與宿主天然免疫相互作用中的功能；將野生株和突變株分別感染小鼠來源巨噬細(xì)胞，檢測(cè)其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖。此外，還檢測(cè)了突變株對(duì)酸性環(huán)境的耐受情況。結(jié)果顯示，mkl基因突變株感染斑馬魚成魚后25 d內(nèi)沒有魚死亡；在斑馬魚幼魚感染模型和細(xì)胞感染模型中，突變株的增殖明顯減弱；突變株對(duì)酸性環(huán)境壓力更敏感。以上結(jié)果提示，mkl基因在海分枝桿菌抵抗宿主免疫及致病中發(fā)揮重要作用。

海分枝桿菌；mkl基因；巨噬細(xì)胞；斑馬魚感染模型

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M.tuberculosis）是引起人類結(jié)核病的元兇，但由于多種因素，如其強(qiáng)致病性和傳染性，研究結(jié)核分枝桿菌需在生物安全三級(jí)（biosafety level 3，BSL-3）實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行；其生長(zhǎng)緩慢（倍增時(shí)間15～20 h），所以對(duì)其致病機(jī)制了解很不全面。近年來，將海分枝桿菌（Mycobacterium marinum）作為結(jié)核分枝桿菌的模式菌來研究其致病機(jī)制逐漸得到人們的認(rèn)可和重視。海分枝桿菌在基因組水平與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群最接近，其天然宿主為魚類和兩棲類，能引起魚類結(jié)核病。雖然結(jié)核分枝桿菌小鼠感染模型是研究結(jié)核分枝桿菌致病機(jī)制的有力工具，但常用的C57BL／6或BALB／c小鼠均不能有效模擬人結(jié)核病的病理特征［1］，特別是其肉芽腫結(jié)構(gòu)模糊，缺少纖維化和低氧［2］。而海分枝桿菌感染斑馬魚（Danio rerio，俗稱zebrafish）成魚后的典型病理特征（肉芽腫的形成）與人結(jié)核病的病理非常相似［3，4］，成為很好的研究結(jié)核病肉芽腫形成等病理機(jī)制的模型。此外，使用熒光標(biāo)記的海分枝桿菌感染透明的斑馬魚幼魚，結(jié)合熒光顯微鏡技術(shù)可實(shí)時(shí)追蹤細(xì)菌在體內(nèi)的感染過程及細(xì)菌與宿主細(xì)胞的相互作用，可清晰地解析結(jié)核病的早期病理［5－7］，這也是其他結(jié)核病動(dòng)物模型所不具備的優(yōu)勢(shì)。目前利用該模型研究結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制取得了很好的成果，越來越受重視并得到廣泛應(yīng)用［8－10］，本研究也使用該模型。

結(jié)核分枝桿菌Mce蛋白家族最初被認(rèn)為影響分枝桿菌進(jìn)入宿主的過程，與分枝桿菌毒力相關(guān)。但其操縱子中大多數(shù)基因的功能仍未知，可能與脂質(zhì)代謝或氧化還原反應(yīng)有關(guān)［11］。每個(gè)結(jié)核分枝桿菌mce操縱子中包含2個(gè)yrbE基因（yrbEA和yrbEB）和6個(gè)mce基因（mceA、mceB、mceC、mceD、mceE和mceF）。mce操縱子可能編碼ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，其編碼的YrbE和Mce蛋白分別與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的通透酶和底物結(jié)合蛋白（substrate-binding protein，SBP）同源［11］。mce操縱子編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)需ATPase的參與。以前研究者將Rv0655基因編碼的ATPase命名為Mkl［12］，可能為mce1和mce4操縱子編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)提供能量［13］。研究指出，mkl及mce4缺陷型結(jié)核分枝桿菌體外攝取及代謝膽固醇的能力急劇下降，當(dāng)膽固醇作為唯一碳源時(shí)突變菌株生長(zhǎng)緩慢［14］，提示Mkl可能與Mce4介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。此外，mkl缺陷型結(jié)核分枝桿菌在小鼠體內(nèi)的存活率顯著降低［13］，提示Mkl對(duì)分枝桿菌的致病有重要作用。本研究在海分枝桿菌轉(zhuǎn)座子突變庫中鑒定了一株mkl突變株，針對(duì)mkl基因?qū)７种U菌致病的影響及相關(guān)機(jī)制開展了進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及噬菌體海分枝桿菌ATCCBAA-535（M菌株）及大腸埃希菌DH5α pir116均由加拿大多倫多大學(xué)劉軍教授饋贈(zèng)，恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，M.smegmatis）mc2155由美國斯坦福大學(xué)Small P教授惠贈(zèng)，分枝桿菌溫敏噬菌體phagemid MycoMar T7由美國哈佛大學(xué)Rubin EJ教授惠贈(zèng)，綠色熒光質(zhì)粒pTEC15由美國華盛頓大學(xué)Ramakrishnan L教授惠贈(zèng)。

1.1.2 動(dòng)物和細(xì)胞斑馬魚成魚購自上海聯(lián)友水族；斑馬魚AB品系胚胎：種魚由國家斑馬魚模式動(dòng)物中心饋贈(zèng)，實(shí)驗(yàn)室專人繁育飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前1 d進(jìn)行孵化準(zhǔn)備。小鼠來源巨噬細(xì)胞系Raw264.7購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.3 儀器和試劑實(shí)驗(yàn)儀器包括相差顯微鏡（Zeiss Axiovert 200M microscope，Carl Zeiss公司）、0.1 mm Zirconia／Silica beads（Biospec公司）和常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（2720 Thermal Cycler，Applied Biosystems公司）。試劑包括膠回收試劑盒（Tiangen公司）、質(zhì)粒抽提試劑盒（Tiangen公司）、Trizol（Life Technology公司）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）、PTU（Sigma-Aldrich公司）等。

1.2 方法

1.2.1 海分枝桿菌的培養(yǎng)海分枝桿菌為光產(chǎn)色細(xì)菌，需32℃避光培養(yǎng)。常規(guī)液體培養(yǎng)基為含10%OADC的7H9培養(yǎng)基；常規(guī)固體培養(yǎng)基為含10%OADC的7H10培養(yǎng)基［15］。必要時(shí)添加抗生素卡那霉素40μg／ml或潮霉素50μg／ml。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及測(cè)序轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)鑒定測(cè)序引物TLP1：5′-CTGGACAAGGGAAAACGC-3′。mkl∷Tn菌株MMAR＿0994基因互補(bǔ)PCR引物MMAR＿0994 CO Fw：5′-CGGCATTGGAAGGATTTCCC-3′；MMAR＿0994 CO Rv：5′-GACTAGTTCAGCGGTGGGTGCCCT-3′。MMAR＿0993、MMAR＿0994共轉(zhuǎn)錄鑒定PCR引物F1：5′-CAATGACGGGCGCGTAACGG-3′；R1：5′-GGG-AAATCCTTCCAATGCCGATGCC-3′。MMAR＿0994、MMAR＿0995共轉(zhuǎn)錄鑒定PCR引物F2：5′-CCGCCGTCCAGGGTCTAGC-3′；R2：5′-CGAACGAACTACCCGGATCTCACGC-3′。引物合成及插入位點(diǎn)測(cè)序均由上海Invitrogen公司完成。

1.2.3 突變基因的鑒定抗性標(biāo)志挽救法確定轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)，參見文獻(xiàn)［16］。

1.2.4 海分枝桿菌mkl基因與上下游基因共轉(zhuǎn)錄鑒定收集海分枝桿菌培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗后，用Trizol抽提RNA，將所得RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，海分枝桿菌RNA及cDNA制備具體方法參見文獻(xiàn)［17］。用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR，鑒定mkl基因與上下游基因共轉(zhuǎn)錄情況。

1.2.5 海分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖檢測(cè)檢測(cè)方法參見文獻(xiàn)［18］。小鼠來源巨噬細(xì)胞系Raw264.7培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、0.5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整密度為105／ml。將上述細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板（1 ml／孔），37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待單層細(xì)胞貼于板壁上即可用于侵染實(shí)驗(yàn)。制備單細(xì)胞懸液，于每孔加入1 ml上述菌液，共培養(yǎng)4 h﹝感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為1﹞。在指定時(shí)間點(diǎn)去除培養(yǎng)基，每孔加0.1 ml 0.1%Triton-X100，于32℃培養(yǎng)箱中孵育15 min，裂解細(xì)胞，胞內(nèi)細(xì)菌用無菌PBS梯度稀釋并鋪板，32℃培養(yǎng)，計(jì)菌落形成單位（colony-forming unit，CFU）。

1.2.6 斑馬魚成魚腹腔注射感染斑馬魚的飼養(yǎng)方法見http：／／zfin.org／zf-info／zfbook／zfbk.html。感染前置于待感染的魚缸中喂養(yǎng)1周，使其充分適應(yīng)環(huán)境。用0.1%三卡因（tricaine）浸泡5 min以充分麻醉［3］。海分枝桿菌生長(zhǎng)到600 nm處光密度（optical density，OD）為1.0時(shí)，用PBS將菌液稀釋到106CFU／ml。用4號(hào)注射器吸取10μl，注射入斑馬魚腹腔，每條魚注射約10 000 CFU。觀察感染后不同天數(shù)斑馬魚的存活狀況。

1.2.7 斑馬魚幼魚尾靜脈顯微注射魚卵孵出2 d后將魚卵外層膜去除，置于28℃培養(yǎng)箱中。制備攜帶有pTEC15熒光質(zhì)粒的細(xì)菌懸液，與酚紅染料以10∶1混合，毛細(xì)管針管上樣5μl。在鏡下小心破開針頭，并調(diào)整注射參數(shù)以控制注射量在適當(dāng)范圍，將三卡因麻醉后的幼魚置于鏡下凹玻片中，于尾靜脈處注射。將注射好的幼魚轉(zhuǎn)移入96孔板，每孔保存1條。在感染后不同天數(shù)進(jìn)行觀察、拍照及圖像分析［19］。

1.2.8 對(duì)酸性環(huán)境耐受檢測(cè)配制檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH4.5和pH7.0）。海分枝桿菌接種于含10%OADC的7H9液體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD＝1.0）。將細(xì)菌用PBS洗后稀釋入制備好的緩沖液中，調(diào)節(jié)OD值至0.01，32℃培養(yǎng)2 d，對(duì)培養(yǎng)菌進(jìn)行梯度稀釋鋪板，統(tǒng)計(jì)CFU。

2 結(jié)果

2.1 海分枝桿菌mkl基因突變株的鑒定

本研究從構(gòu)建的海分枝桿菌轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入文庫中鑒定了1株插入位點(diǎn)位于mkl（MMAR＿0994）基因的突變株（圖1），該基因編碼一個(gè)ATP結(jié)合蛋白，其含有ABC＿ATPase超家族蛋白結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，海分枝桿菌mkl基因（MMAR＿0994）與結(jié)核分枝桿菌mkl基因（Rv0655）核酸序列同源度高達(dá)89%，氨基酸同源度高達(dá)88%。

圖1 mkl基因在基因組上的位置Fig.1 Genetic locus of mkl in the genome

為驗(yàn)證該突變株中轉(zhuǎn)座子插入是否影響下游基因的轉(zhuǎn)錄，本研究用反轉(zhuǎn)錄PCR鑒定了mkl基因及其上下游基因的轉(zhuǎn)錄方向。結(jié)果顯示，只有MMAR＿0993與MMAR＿0994（mkl）共轉(zhuǎn)錄，MMAR＿0994（mkl）與MMAR＿0995（rpoB）非共轉(zhuǎn)錄，這與TBDB數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)的同源Rv基因的轉(zhuǎn)錄情況一致（圖2）。

圖2 用RT-PCR鑒定海分枝桿菌mkl基因及其上下游基因共轉(zhuǎn)錄情況Fig.2 The cotranscription results of mkl，the upstream gene MMAR＿0993（the first three lanes），and the downstream gene rpoB（the last three lanes）

2.2 mkl突變使海分枝桿菌在斑馬魚成魚中的毒力明顯減弱

為探討mkl基因與海分枝桿菌毒力的關(guān)系，本研究將野生株與突變株分別感染斑馬魚成魚并觀察斑馬魚的生存情況。在感染后的25 d內(nèi)，對(duì)照PBS組及突變株組斑馬魚沒有出現(xiàn)死亡，進(jìn)食量和活力與感染前無差別。而海分枝桿菌野生株及互補(bǔ)株感染的斑馬魚在1周后逐漸出現(xiàn)活力降低、進(jìn)食下降、腹部腫脹等癥狀，直至死亡。統(tǒng)計(jì)得到如圖3所示的斑馬魚死亡曲線，可見野生株和互補(bǔ)株感染的斑馬魚分別從第15天和第14天開始死亡，斑馬魚半數(shù)死亡時(shí)間分別是18 d和16 d，而突變株組直至觀察結(jié)束沒有魚死亡，表明mkl基因?qū)７种U菌的致病十分重要。

圖3 斑馬魚感染不同海分枝桿菌后的生存曲線Fig.3 The survival curve of zebrafish infected with wildtype，mutant and complementary strains by intraperitoneal injection of M.marinum

2.3 mkl基因突變不影響海分枝桿菌的體外生長(zhǎng)

為檢驗(yàn)mkl基因突變對(duì)細(xì)菌體外生長(zhǎng)有無影響，本研究測(cè)定了突變株及野生株在液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況（圖4）。結(jié)果顯示，兩者生長(zhǎng)無顯著差異，提示mkl基因突變不影響海分枝桿菌的體外生長(zhǎng)。

圖4 海分枝桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of M.marinum

2.4 用斑馬魚幼魚模型研究mkl基因?qū)７种U菌毒力的影響

斑馬魚幼魚在孵化后的2～8 d其免疫力以天然免疫為主，利用斑馬魚幼魚尾靜脈注射模型可評(píng)估突變株在宿主天然免疫時(shí)期毒力變化情況［20，21］。用突變株和野生株分別感染孵化2 d后的斑馬魚幼魚，結(jié)果如圖5A所示，隨著感染天數(shù)增加，突變株和野生株均有不同程度增殖，且野生株比突變株增殖更明顯。野生株感染后，綠色熒光逐漸從感染部位擴(kuò)散到魚的其他部位，而突變株感染后熒光擴(kuò)散不太明顯。對(duì)所得到的15條幼魚第4天和第6天的熒光拍照結(jié)果進(jìn)行積分光密度（integrated optical density，IOD）統(tǒng)計(jì)，突變株與野生株有顯著差異（P＜0.01，t test）（圖5B），表明在海分枝桿菌感染宿主的天然免疫階段，mkl影響細(xì)菌增殖和擴(kuò)散。

2.5 mkl突變株在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖減慢

為進(jìn)一步了解mkl在海分枝桿菌抵抗宿主天然免疫殺傷中的作用，本研究檢測(cè)了野生株、突變株和互補(bǔ)株在巨噬細(xì)胞中的增殖（圖6A）。結(jié)果顯示，在感染巨噬細(xì)胞后的第2、3、4天，突變株與野生株在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量有顯著差異，提示mkl突變使細(xì)菌在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖減慢。

圖5 幼魚尾靜脈感染結(jié)果Fig.5 The zebrafish larvae infected with wild-type，mutant and complementary strains by caudal vein injection of M.marinum

圖6 海分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞系Raw264.7Fig.6 Intracellular survival of the mkl∷Tn mutant

同時(shí)，為探討mkl基因?qū)７种U菌侵染效率的影響，本研究比較了突變株與野生株進(jìn)入巨噬細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果如圖6B所示，與野生株相比，突變株對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的侵染效率沒有顯著改變。

2.6 mkl突變株對(duì)酸性環(huán)境的耐受能力下降

結(jié)核分枝桿菌能在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期存活，很大一部分原因是其能抵抗吞噬體的酸性環(huán)境［22］。本研究檢測(cè)了mkl突變株對(duì)酸性環(huán)境的耐受能力，在pH4.5酸性條件下培養(yǎng)細(xì)菌，分別統(tǒng)計(jì)突變株和野生株的存活量（圖7）。結(jié)果顯示，突變株對(duì)酸性環(huán)境的耐受能力明顯下降（P＜0.05，t test），表明mkl對(duì)細(xì)菌抵抗體內(nèi)酸性壓力環(huán)境十分重要。

圖7 海分枝桿菌對(duì)酸性環(huán)境的耐受能力Fig.7 Mutant was less resistant to low pH environment

3 討論

本研究中，mkl突變株在斑馬魚成魚中的毒力顯著減弱，與以前報(bào)道的小鼠中結(jié)核分枝桿菌感染表型一致，即結(jié)核分枝桿菌mkl突變株在免疫正常小鼠中毒力明顯下降［13］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，mkl突變株在斑馬魚幼魚中的增殖顯著減弱。實(shí)驗(yàn)中所用的斑馬魚幼魚處在孵化后的2～8 d，其適應(yīng)性免疫尚未發(fā)育成熟，處于天然免疫為主階段［20，21］。此外，巨噬細(xì)胞在分枝桿菌與宿主天然免疫系統(tǒng)的相互作用中非常重要，本研究顯示突變株在巨噬細(xì)胞中增殖速度明顯減慢。這些均提示在宿主天然免疫階段，mkl基因?qū)Ψ种U菌的存活及增殖有重要作用。

分枝桿菌侵染巨噬細(xì)胞、在巨噬細(xì)胞內(nèi)增殖、有效阻止溶酶體酸化及殺傷，均為其毒力的重要表現(xiàn)。海分枝桿菌野生株與mkl突變株的侵染效率無差異，表明mkl突變株在巨噬細(xì)胞中增殖減慢并非由于侵染效率下降導(dǎo)致。同時(shí)，本研究觀察到在體外培養(yǎng)條件下，mkl突變株對(duì)酸性環(huán)境（低pH）更為敏感。在巨噬細(xì)胞中分枝桿菌會(huì)遇到酸性環(huán)境，但分枝桿菌具有某些抵抗酸性環(huán)境的機(jī)制，能避免與溶酶體融合，從而能在巨噬細(xì)胞中存活。因此，本研究推測(cè)mkl突變株在巨噬細(xì)胞中遭遇酸性環(huán)境后抵抗能力下降，導(dǎo)致其在巨噬細(xì)胞中的增殖減弱。

對(duì)于mkl基因功能及其影響毒力的具體機(jī)制，目前仍存在許多猜測(cè)。有研究發(fā)現(xiàn)，mkl編碼ATPase，可能為mce4和mce1操縱子編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)提供能量［13］。Mkl還可能與Mce4介導(dǎo)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)［14］。另外，mce4缺陷型、mce1缺陷型及mkl缺陷型結(jié)核分枝桿菌在小鼠體內(nèi)的存活率顯著降低［13］。但mce4突變株只在感染后期毒力有所下降，而mkl突變株在感染早期毒力即減弱，且比mce1、mce4突變株毒力下降更明顯。本研究也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，mkl突變株在宿主天然免疫階段便有顯著的毒力下降，表明mkl突變株導(dǎo)致毒力下降的可能原因并不局限于Mkl與mce4操縱子編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相互作用，Mkl極可能與mce1或其他mce操縱子編碼的蛋白也相互作用。另外，mkl基因在位置上與mce操縱子離得很遠(yuǎn)，因此Mkl可能也為其他轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)提供能量。

綜上所述，本研究在斑馬魚成魚和幼魚及巨噬細(xì)胞感染模型中均觀察到mkl突變株的毒力相對(duì)野生株顯著減弱，提示mkl基因在細(xì)菌抵抗宿主適應(yīng)性免疫和天然免疫中均有重要功能。另外，突變株對(duì)酸性環(huán)境更敏感，也提示mkl突變株在巨噬細(xì)胞中增殖減弱可能是其抵抗巨噬細(xì)胞酸性環(huán)境的能力下降所致。總之，本研究進(jìn)一步明確了mkl基因在分枝桿菌致病中的重要作用，特別是在抵抗宿主天然免疫中不可或缺。

［1］ O’Garra A，Redford PS，McNab FW，Bloom CI，Wilkinson RJ，Berry MP.The immune response in tuberculosis［J］.Annu Rev Immunol，2013，31：475-527.

［2］ Via LE，Lin PL，Ray SM，Carrillo J，Allen SS，Eum SY，Taylor K，Klein E，Manjunatha U，Gonzales J，Lee EG，Park SK，Raleigh JA，Cho SN，McMurray DN，F(xiàn)lynn JL，Barry CE3rd.Tuberculous granulomas are hypoxic in guinea pigs，rabbits，and nonhuman primates［J］.Infect Immun，2008，76（6）：2333-2340.

［3］ Swaim LE，Connolly LE，Volkman HE，Humbert O，Born DE，Ramakrishnan L.Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity［J］.Infect Immun，2006，74（11）：6108-6117.

［4］ Tobin DM，Ramakrishnan L.Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis［J］.Cell Microbiol，2008，10（5）：1027-1039.

［5］ Davis JM，Clay H，Lewis JL，Ghori N，Herbomel P，Ramakrishnan L.Real-time visualization of Mycobacteriummacrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos［J］.Immunity，2002，17（6）：693-702.

［6］ Pozos TC，Ramakrishnan L.New models for the study of Mycobacterium-host interactions［J］.Curr Opin Immunol，2004，16（4）：499-505.

［7］ Lesley R，Ramakrishnan L.Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish［J］.Curr Opin Microbiol，2008，11（3）：277-283.

［8］ Clay H，Davis JM，Beery D，Huttenlocher A，Lyons SE，Ramakrishnan L.Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish［J］.Cell Host Microbe，2007，2（1）：29-39.

［9］ Tobin DM，Vary JC Jr，Ray JP，Walsh GS，Dunstan SJ，Bang ND，Hagge DA，Khadge S，King MC，Hawn TR，Moens CB，Ramakrishnan L.The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans［J］.Cell，2010，140（5）：717-730.

［10］ Roca FJ，Ramakrishnan L.TNF dually mediates resistance and susceptibility to mycobacteria via mitochondrial reactive oxygen species［J］.Cell，2013，153（3）：521-534.

［11］ Casali N，Riley LW.A phylogenomic analysis of the Actinomycetales mce operons［J］.BMC Genomics，2007，8：60.

［12］ Dassa E，Bouige P.The ABC of ABCS：aphylogenetic and functional classification of ABC systems in living organisms［J］.Res Microbiol，2001，152（3-4）：211-229.

［13］ Joshi SM，Pandey AK，Capite N，F(xiàn)ortune SM，Rubin EJ，Sassetti CM.Characterization of mycobacterial virulence genes through genetic interaction mapping［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（31）：11760-11765.

［14］ Pandey AK，Sassetti CM.Mycobacterial persistence requires the utilization of host cholesterol［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（11）：4376-4380.

［15］ Yu J，Niu C，Wang D，Li M，Teo W，Sun G，Wang J，Liu J，Gao Q.MMAR＿2770，a new enzyme involved in biotin biosynthesis，is essential for the growth of Mycobacterium marinum in macrophages and zebrafish［J］.Microbes Infect，2011，13（1）：33-41.

［16］ Alexander DC，Jones JR，Tan T，Chen JM，Liu J.PimF，a mannosyltransferase of mycobacteria，is involved in the biosynthesis of phosphatidylinositol mannosides and lipoarabinomannan［J］.J Biol Chem，2004，279（18）：l8824-l8833.

［17］ Pettersson BM，Nitharwal RG，Das S，Behra KP，Benedik E，Arasu UT，Islam NM，Dasgupta S，Bhattacharya A，Kirsebom LA.Identification and expression of stressosomal proteins in Mycobacterium marinum under various growth and stress conditions［J］.FEMS Microbiol Lett，2013，342（2）：98-105.

［18］ Ramakrishnan L，F(xiàn)alkow S.Mycobacterium marinum persists in cultured mammalian cells in a temperaturerestricted fashion［J］.Infect Immun，1994，62（8）：3222-3229.

［19］ Takaki K，Davis JM，Winglee K，Ramakrishnan L.Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum infection in zebrafish［J］.Nat Protoc，2013，8（6）：1114-1124.

［20］ Lam SH，Chua HL，Gong Z，Lam TJ，Sin YM.Development and maturation of the immune system in zebrafish，Danio rerio：agene expression profiling，in situ hybridization and immunological study［J］.Dev Comp Immunol，2004，28（1）：9-28.

［21］ Page DM，Wittamer V，Bertrand JY，Lewis KL，Pratt DN，Delgado N，Schale SE，McGue C，Jacobsen BH，Doty A，Pao Y，Yang H，Chi NC，Magor BG，Traver D.An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish［J］.Blood，2013，122（8）：e1－e11.

［22］ Ehrt S，Schnappinger D.Mycobacterial survival strategies in the phagosome：defence against host stresses［J］.Cell Microbiol，2009，11（8）：1170-1178.

The potential role of Mycobacterium marinum mkl gene in bacterial resistance to the host immunity

HUA Yi-Fei，WANG Qing-Lan，NIU Chen，GAO Qian
Key Laboratory of Medical Molecular Virology of Ministries of Education and Health，School of Basic Medical Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China

A Mycobacterium marinum random mutant library using MycoMarT7 phage system was constructed.After screening，a mutant whose transposon insertion site was in MMAR＿0994（mkl）gene was obtained.The adult zebrafish were infected with the wild-type and the mutant strains respectively and the survival rates of the zebrafish were compared.The potential impact of the mutant on host innate immune system was tested by infecting the 48-hour post-fertilization zebrafish larvae using caudal vein injection.In vivo distribution of the bacteria was monitored by following green fluorescence in the larvae.The impact of the mutant on mouse macrophage cell line was tested.In addition，the acid tolerance level was also checked.The results showed that mkl mutant displayed attenuated virulence in the zebrafish infection model.The attenuated phenotypes in the zebrafish larvae and mouse macrophage cell line were observed.The invasion rates of the mutant and the wild-type were similar.The growth of the mutant was more sensitive to low pH.These results indicated that mkl may play a functional role in the interaction with host immune system.

Mycobacterium marinum；mkl gene；Macrophage；Zebrafish infection model

s.GAO Qian，E-mail：qiangao＠shmu.edu.cn；NIU Chen，E-mail：chniu＠fudan.edu.cn

2014－10－31）

國家自然科學(xué)基金（81271790、81201256）

高謙，牛辰