申茉函 王全才 楊 麗

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110004)

阿爾茨海默病(AD)的主要病理特征是細(xì)胞外老年斑的形成和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)的集聚，而β淀粉樣蛋白(Aβ)是老年斑的主要成分，在老年斑的形成過(guò)程中具有神經(jīng)元毒性，其作用依賴于多肽的聚集狀態(tài)與蛋白濃度，主要的毒性片段是 Aβ1～42，是 AD 的主要致病原因。本實(shí)驗(yàn)研究 Aβ1～42對(duì)U251細(xì)胞的影響，觀察其損傷細(xì)胞的途徑，以討論AD的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng);重組人 Aβ1～42(rhAβ1～42)已制備并純化;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;AO購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司;EB購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;β-actin、Bax、Bcl-2抗體(北京博士德公司)。rhAβ1～42在37℃溫箱孵育7 d。

1.2 U251的培養(yǎng)及擴(kuò)增 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的培養(yǎng)選用DMEM高糖培養(yǎng)基，含10%小牛血清，在37℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶消化后分瓶傳代。

1.3 形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞，向培養(yǎng)液中分別添加0.5、1、5、10和20μmol/L的Aβ1～42，以未加者為對(duì)照組，培養(yǎng)24 h后，加入AO/EB染料于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 MTT試驗(yàn) 細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%鋪滿表面時(shí)，以0.25%胰酶溶液消化，用含10%小牛血清的相應(yīng)培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整為6×106/ml。每孔100μl接種96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24 h，再向培養(yǎng)液中分別添加 0.5、1、5、10 和 20、30 μmol/L的 Aβ1～42，每個(gè)濃度組 4 復(fù)孔，每孔加入 5 g/L 的MTT 20μl，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸出上清液，每孔加入150μl的二甲基亞砜(DMSO)，充分震蕩使細(xì)胞溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度A值，計(jì)算U251細(xì)胞對(duì)藥的生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=〔1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值〕×100%。

1.5 透射電鏡 Aβ1～42加入體外培養(yǎng)7 d的神經(jīng)干細(xì)胞，使其終濃度為10μmol/L。37℃孵育48 h后，對(duì)照組加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的培養(yǎng)液。收集細(xì)胞，PBS洗3次，離心，沉淀用4%戊二醛固定，4℃放置2 h。1%鋨酸4℃固定1 h;棄去鋨酸培養(yǎng)液，PBS洗2次，每次20 min。0.5%醋酸雙氧鈾預(yù)染，室溫，搖床過(guò)夜。30%、50%、70%、90%、100% 梯度乙醇脫水各15 min;最后用100%乙醇脫水2次，每次10 min。Epon812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)半薄切片定位后做超薄切片。1%醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛雙重染色。JEM-1200EX透射電子顯微鏡觀察，拍照。

1.6 Western印跡檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 作用24 h后分別收集空白對(duì)照組、Aβ1～42終濃度分別為 0.5，1，5，10 和20μmol/L劑量組的細(xì)胞，PBS洗3次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，裂解后離心取上清，用Bradford法測(cè)定各種蛋白的濃度。分別取蛋白樣品，按體積比4∶1加入上樣緩沖液，100℃、5 min變性，經(jīng)SDS-PAGE(5%濃縮膠，18%分離膠)電泳分離后，將蛋白電轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜，經(jīng)脫脂奶粉封閉液封閉，將硝酸纖維素膜分別加入稀釋后一抗，再用相應(yīng)辣根過(guò)氧化物酶(HPR)標(biāo)記的二抗稀釋液孵育，用ECL發(fā)光法檢測(cè)不同樣品各種蛋白表達(dá)狀況。以Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)分析圖像，用目的蛋白條帶的平均光強(qiáng)度值與β-actin條帶的平均光強(qiáng)度值的比值表示該蛋白表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 rhAβ1～42對(duì)U251細(xì)胞增殖能力的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度rhAβ1～42作用U251細(xì)胞24 h后，對(duì)細(xì)胞增殖顯示出一定的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01 vs陰性對(duì)照組)。當(dāng)rhAβ1～42作用濃度為20μmol/L時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制率最高，為27.55%(P＜0.01 vs陰性對(duì)照組);提高 rhAβ1～42濃度至30μmol/L，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用與20μmol/L劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見(jiàn)圖1，圖2。

2.2 AO/EB雙染 陰性對(duì)照組無(wú)明顯凋亡細(xì)胞(圖3A)。實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)早期凋亡細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞核為AO染色呈黃綠色熒光，濃聚成新月形或顆粒狀，位于細(xì)胞一側(cè)(圖3B)。隨著rhAβ1～42作用濃度的增大和時(shí)間延長(zhǎng)，早期凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，晚期凋亡細(xì)胞也增多，后者表現(xiàn)為細(xì)胞核EB染色呈橘紅色，濃聚和偏向(圖3C)。細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞體積增大，呈不均勻的紅色熒光，輪廓不清(圖3D)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞隨給藥濃度的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡、死亡比例增加，細(xì)胞凋亡、壞死與rhAβ1～42的作用具有濃度和時(shí)間相關(guān)效應(yīng)。

2.3 Western印跡檢測(cè)結(jié)果 不同濃度的rhAβ1～42作用U251細(xì)胞后，Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，其效應(yīng)具有濃度梯度依賴性，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)。見(jiàn)圖4。

2.4 透射電鏡觀察 陰性對(duì)照組的細(xì)胞表面有微絨毛，核大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基體等結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)(圖5A);實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核移位、染色質(zhì)凝聚、細(xì)胞空泡化，核膜核仁完整性破壞，核膜破損(圖5B、圖5C)。

圖1 MTT法檢測(cè)不同濃度rhAβ1～42對(duì)U251細(xì)胞增殖影響的OD值

圖2 不同濃度rhAβ1～42對(duì)U251細(xì)胞的增殖抑制率

圖3 AO/EB雙染法觀察U251細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變(×200)

圖4 Western印跡檢測(cè)凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)

圖5 透射電鏡觀察應(yīng)用rhAβ1～42后U251細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變(×7 500)

3 討論

Aβ在正常神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞中不斷地分泌，并向細(xì)胞外釋放，進(jìn)入腦背液〔1〕。Aβ 的肽鏈長(zhǎng)短不同，Aβ1～42更易于形成斑塊樣沉積，而Aβ1～40則更傾向于形成典型的纖維。所以，Aβ1～42是構(gòu)成老年斑的核心，而 Aβ1～40主要起到延長(zhǎng)纖維的作用〔2〕。斑塊的形成過(guò)程首先是Aβ1～42分子間聚集形成淀粉樣斑塊的核心，由于 Aβ1～40和 Aβ1～42不斷地加入、聚集使核心擴(kuò)大。由于沉積的Aβ本身有神經(jīng)毒性，會(huì)引起神經(jīng)元變性甚至凋亡。神經(jīng)元凋亡的機(jī)制一方面是通過(guò)半胱氨酸、天冬氨酸特異性蛋白酶起作用;另一方面是Aβ對(duì)凋亡基因部位有影響，Bcl-2蛋白家族在細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中則起關(guān)鍵作用?？沟蛲龅闹饕荁cl-2和Bcl-xL，促進(jìn)凋亡的是Bax和Bad。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，Aβ1～42能促進(jìn)Bax的表達(dá)，加速腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞活性增高，神經(jīng)元的凋亡，激發(fā)體內(nèi)炎癥反應(yīng)等，導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白纖維周圍出現(xiàn)一系列病理?yè)p傷，最終形成老年斑〔3〕。電鏡下可以看到，老年斑的核心部分為淀粉樣沉積物，它是由6 nm的細(xì)絲成束排列，老年斑外圍為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和變性神經(jīng)末梢，后者主要是突觸前結(jié)構(gòu)，其直徑為正常神經(jīng)末梢的5～10倍，內(nèi)部含有大量圓形致密的小體，可能是變性線粒體等，其中可見(jiàn)呈放射狀排列的淀粉樣沉積物，這些淀粉樣沉積物在AD腦組織及腦膜的微小血管的管壁上，故稱為腦血管淀粉樣變性〔4〕。可見(jiàn)，Aβ沉積在血管壁成為腦血管淀粉樣變性，沉積在大腦實(shí)質(zhì)成為老年斑。

U251細(xì)胞屬于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，與神經(jīng)元有一定的相似之處〔5〕，廣泛應(yīng)用于研究離子通道、受體、遞質(zhì)分泌的實(shí)驗(yàn)中，也是研究神經(jīng)毒性常用的細(xì)胞株。本研究表明，在0.5～20μmol/L的濃度內(nèi)，rhAβ1～42對(duì)U251細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯上升，細(xì)胞毒性作用顯著增強(qiáng)，說(shuō)明rhAβ1～42對(duì)U251細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用存在一定的量效依賴關(guān)系。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體對(duì)有害因素引起損害的自衛(wèi)反應(yīng)。Aβ誘導(dǎo)凋亡的研究主要集中在揭示具體的凋亡信號(hào)通路。Yao等〔6〕認(rèn)為，Aβ首先激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)，引起抗凋亡基因Bcl-w表達(dá)減少以及線粒體促凋亡蛋白Smac的釋放，繼而引起細(xì)胞凋亡。抑制JNK的表達(dá)可有效阻止Aβ引起的細(xì)胞凋亡。Hsu等〔7〕發(fā)現(xiàn)，Aβ 能夠通過(guò) PP-A-ASK1-p38MAPK-p53-Bax途徑誘導(dǎo)大腦內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Aβ首先激活蛋白磷酸酶 (PP)-A，PP-A再激活A(yù)SK1，ASK1再激活p38MAPK，后者又激活了p53和Bax的表達(dá)。核因子(NF)-κB，作為一個(gè)可誘導(dǎo)形式定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可被AGEs激活。研究顯示Aβ呈現(xiàn)兩期效應(yīng)，低劑量時(shí)激活NF-κB，在神經(jīng)元中作為重要的抗凋亡因子，對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用;而高劑量則下調(diào)NF-κB的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在對(duì) Aβ具有抗性的細(xì)胞內(nèi)均有基本的 NF-κB活性表達(dá)〔8〕。在AD 中，NF-κB 活性明顯下調(diào)，同時(shí)伴隨著進(jìn)行性死亡。

本實(shí)驗(yàn)中，采用AO、EB兩種熒光染料雙染色，AO能透過(guò)完整細(xì)胞膜，嵌入細(xì)胞核DNA中(包括正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞)，使之發(fā)出亮綠色熒光;EB只能透過(guò)膜受損的細(xì)胞，嵌入核DNA(包括晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞)，發(fā)橘紅色熒光，可見(jiàn)濃縮的DNA碎片或凋亡小體。因此，正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、死亡細(xì)胞之間的區(qū)別主要是通過(guò)細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化來(lái)判斷的。凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)為染色增強(qiáng)，均勻一致的圓珠狀或固縮狀、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，在有的細(xì)胞中還可見(jiàn)到膜包裹的核碎片及細(xì)胞器形成的凋亡小體，芽生突出細(xì)胞表面;非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征，二者形態(tài)迥異，用這種方法可了解rhAβ1～42誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。

Bcl-2蛋白發(fā)揮線粒體膜通透性的抑制效應(yīng)機(jī)制可能因其抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+的重新分布，阻斷某些因素的促凋亡過(guò)程;參與細(xì)胞色素C的釋放;作為一種抗氧化劑，阻斷氧化作用對(duì)細(xì)胞組分的破壞;與線粒體ATP產(chǎn)量正相關(guān)〔9～11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中Bcl-2/Bax的表達(dá)特點(diǎn)說(shuō)明rhAβ1～42對(duì)U251細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與線粒體凋亡路徑的調(diào)控有關(guān)。筆者認(rèn)為，Aβ1～42對(duì)U251細(xì)胞的損傷主要是通過(guò)凋亡途徑，對(duì)其生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，其抑制作用可能是通過(guò)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

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