許波 徐志斌 洪振強(qiáng)

【摘 要】目的：通過觀察陽(yáng)和湯對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）的影響，探討陽(yáng)和湯防治骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。方法：將24只健康新西蘭兔隨機(jī)分為陽(yáng)和湯組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型對(duì)照組、空白對(duì)照組，每組6只。除空白對(duì)照組外，其余各組均采用木瓜蛋白酶造模方法建立骨關(guān)節(jié)炎模型。陽(yáng)和湯組以陽(yáng)和湯灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組以筋骨痛消丸灌胃，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組以生理鹽水灌胃，每日1次，持續(xù)給藥5周。采用HE染色觀察軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測(cè)關(guān)節(jié)液中SOD、NO含量的變化。結(jié)果：HE染色：軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)陽(yáng)和湯組與陽(yáng)性對(duì)照組明顯優(yōu)于模型對(duì)照組。關(guān)節(jié)軟骨組織損傷Mankin's評(píng)分：與空白對(duì)照組比較，其余3組評(píng)分明顯增加

（P < 0.05）；陽(yáng)和湯組、陽(yáng)性對(duì)照組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；陽(yáng)和湯組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。ELISA檢測(cè)法：陽(yáng)和湯組與陽(yáng)性對(duì)照組關(guān)節(jié)液中SOD含量均高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；陽(yáng)和湯組與陽(yáng)性對(duì)照組關(guān)節(jié)液中NO含量均低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。結(jié)論：陽(yáng)和湯可以通過升高兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)液中SOD含量，降低其NO含量，從而對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎起到治療作用。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；陽(yáng)和湯；兔；關(guān)節(jié)液；SOD；NO

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.09.002

Effect of Yanghe Decoction（陽(yáng)和湯） on SOD and NO in the Synovial Fluid of Rabbits with Knee Osteoarthritis

XU Bo，XU Zhi-bin，HONG Zhen-qiang

【ABSTRACT】 Objective：To study the mechanism of Yanghe Decoction （陽(yáng)和湯） in the prevention and treatment of osteoarthritis by observing its effect on SOD and NO in the synovial fluid of rabbits with knee osteoarthritis.Methods：24 healthy New Zealand rabbits were randomly divided into a Yanghe Decoction group，a positive control group，a model control group and a blank control group，6 rats in each.Except for the blank control group，the other groups were used to establish ostarthritis models with papain.The Yanghe Decoction group was given intragastric administration with Yanghe Decoction，the positive control group with Jingu Tongxiao Pill （筋骨痛消丸） and the model control group and blank control group with physiological saline，once a day for five weeks.HE staining was used to observe the changes of the morphosis of cartilage，and ELISA was used to detect the changes of SOD and NO in synovial fluid.Results：HE staining：The cartilage morphosis in the Yanghe Decoction group and the positive control group was significantly better than that of the model control group.Mankin score of articular cartilage tissue injury：Compared with the blank control group，the integrals in the other three groups increased significantly （P < 0.05）；the differences of that between Yanghe Decoction group，the positive control group and the model control group were statistically significant （P < 0.05）；the difference of that between the Yanghe Decoction group and the positive control group was not statistically significant （P > 0.05）.ELISA：The content of SOD in the Yanghe Decoction group and the positive control group was higher than that in the model control group，the difference being statistically significant （P < 0.05）；the content of NO in the Yanghe Decoction group and the positive control group was lower than that in the model control group，the difference being statistically significant （P < 0.05）.Conclusion：Yanghe Decoction can be used to treat knee osteoarthritis by increasing the content of SOD and decreasing the content of NO in the synovial fluid.

【Keywords】osteoarthritis；Yanghe Decoction（陽(yáng)和湯）；rabbit；synovial fluid；SOD；NO

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種由多種因素引起的以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，又稱骨關(guān)節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)

病[1]。有調(diào)查研究顯示，在我國(guó)老齡人群中，

65歲以上人群OA發(fā)病率超過50%，75歲以上人群則高于80%[2]。OA引起關(guān)節(jié)不適和疼痛，導(dǎo)致日?；顒?dòng)能力下降，后者引起肌肉衰弱，進(jìn)一步削弱日常活動(dòng)能力，引發(fā)惡性循環(huán)。正常情況下，關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的降解和修復(fù)處于一種持續(xù)的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，并受體內(nèi)多種蛋白分子的調(diào)節(jié)和控制[3]。已有研究表明，陽(yáng)和湯可通過維持軟骨的動(dòng)態(tài)平衡，延緩OA軟骨退變[4]。但對(duì)兔膝OA模型關(guān)節(jié)液中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）的影響仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，故本文旨在探討陽(yáng)和湯防治OA的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭兔24只（合格證號(hào)2007001103277），清潔級(jí)，體質(zhì)量2.5～3.5 kg，雌雄各半，上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供，許可證號(hào)SCXK（滬） 2012-0011。福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供清潔級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施，許可證號(hào)SCXK（閩）2012-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器 陽(yáng)和湯[藥物組成：熟地黃30 g、肉桂（去皮研粉）3 g、麻黃2 g、鹿角膠9 g、白芥子6 g、姜炭2 g、生甘草3 g。由福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂提供]；筋骨痛消丸（河南省洛藥制藥廠生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10970117）；木瓜蛋白酶（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)107147）；兔SOD、兔NO酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；酶標(biāo)分析儀、離心機(jī)及光鏡等相關(guān)實(shí)驗(yàn)儀器由福建中西醫(yī)結(jié)合研究院提供。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組 將24只4～6月齡健康新西蘭兔隨機(jī)分為陽(yáng)和湯組、陽(yáng)性對(duì)照組、模型對(duì)照組、空白對(duì)照組，每組6只。

2.2 造模方法 除空白對(duì)照組外，其余3組均參照文獻(xiàn)[5-6]制備OA模型：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的戊巴比妥鈉30 mg·kg-1靜脈注射麻醉后，雙后腿膝關(guān)節(jié)周圍剃毛；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的異丙醇消毒皮膚，輕度彎曲膝關(guān)節(jié)，經(jīng)關(guān)節(jié)正中或兩側(cè)進(jìn)針；將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%的木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.5 mL通過髕上韌帶注入兔膝關(guān)節(jié)腔，隔3日1次，連續(xù)注射3次。每日強(qiáng)迫動(dòng)物活動(dòng)30 min，分2次進(jìn)行，連續(xù)驅(qū)趕4周后可獲得OA模型。實(shí)驗(yàn)過程中，造模成功率100%。

2.3 藥物干預(yù) 造模4周后，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組、陽(yáng)和湯組分別給予筋骨痛消丸和陽(yáng)和湯灌胃，每日1次，連續(xù)給藥5周。每次用量根據(jù)Meeh-Rubner公式：A = K×W2/3×10-4，按成人體表面積與家兔體表面積換算[7]。

2.4 標(biāo)本的采集與制備 標(biāo)本采集前各組動(dòng)物禁食24 h，在耳緣靜脈注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的戊巴比妥鈉30 mg·kg-1進(jìn)行全身麻醉?？諝馑ㄈ幩缹?shí)驗(yàn)動(dòng)物后，行髕骨內(nèi)緣縱行切口，逐層分離，保持術(shù)區(qū)無出血，分離至關(guān)節(jié)囊，反復(fù)屈伸活動(dòng)關(guān)節(jié)，將關(guān)節(jié)液擠壓至髕上囊內(nèi)側(cè)，在關(guān)節(jié)液最集中處輕輕劃開關(guān)節(jié)囊，向內(nèi)注入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉注射液1.5 mL，反復(fù)抽吸10遍，盡量將液體抽出，注入1.5 mL EP管中，4 ℃置于15 000 r·min離心機(jī)離心15 min，取上清液，冷藏于-80 ℃的冰箱內(nèi)待測(cè)[8]。取雙膝關(guān)節(jié)股骨髁，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定，常規(guī)脫鈣、包埋和切片，采用HE染色，觀察軟骨組織形態(tài)的變化。

2.5 檢測(cè)方法

2.5.1 HE染色 切片脫蠟至水，蘇木素染液染色30 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸酒精分化液分色3 s，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的伊紅液染色5 s，脫水透明封片，觀察軟骨結(jié)構(gòu)形態(tài)。參考Mankin's骨關(guān)節(jié)病組織學(xué)分級(jí)方法進(jìn)行評(píng)分。

2.5.2 ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液中SOD、NO含量 嚴(yán)

格按照試劑盒使用說明書，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，OD值作為縱坐標(biāo)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的4-Parameter回歸方程，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 HE染色 空白對(duì)照組軟骨基質(zhì)染成粉紅色，著色均勻，軟骨細(xì)胞核呈深藍(lán)色，胞漿呈粉紅色，軟骨表面光滑，表層細(xì)胞較小，呈長(zhǎng)扁形，平行于軟骨表面排列；移行層細(xì)胞較大，呈圓形或橢圓形；放射層細(xì)胞趨于柱狀排列，散在分布。細(xì)胞排列整齊，四層結(jié)構(gòu)清晰，潮線完整，見圖1（1）。模型對(duì)照組軟骨表面粗糙不整，表層軟骨破裂、缺損、凹凸不平，有簇集現(xiàn)象，細(xì)胞排列紊亂，四層結(jié)構(gòu)不清晰，潮線多不清晰、完整，見圖1（2）。陽(yáng)和湯組和陽(yáng)性對(duì)照組差別較小，關(guān)節(jié)軟骨表面存在表淺裂隙，但較模型對(duì)照組有一定程度的修復(fù)，軟骨細(xì)胞排列輕度紊亂，未見大量軟骨細(xì)胞簇集，可見軟骨細(xì)胞增生，潮線清晰、完整程度較模型對(duì)照組改善，見圖1（3）、圖1（4）。

3.2 各組關(guān)節(jié)軟骨組織損傷Mankin's評(píng)分結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，其余3組明顯增加（P < 0.05）；陽(yáng)和湯組、陽(yáng)性對(duì)照組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；陽(yáng)和湯組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

表1 各組關(guān)節(jié)軟骨組織損傷Mankin's評(píng)分結(jié)果 分，

組別 動(dòng)物數(shù)（只） Mankin's評(píng)分

空白對(duì)照組 6 1.51±0.62

模型對(duì)照組 6 10.67±2.151）

陽(yáng)和湯組 6 7.21±1.941）2）

陽(yáng)性對(duì)照組 6 7.04±1.471）2）3）

注 與空白對(duì)照組比較，1）P < 0.05；與模型對(duì)照組比較，2）P < 0.05；與陽(yáng)和湯組比較，3）P > 0.05

3.3 各組關(guān)節(jié)液中SOD和NO的含量比較 與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組關(guān)節(jié)液中SOD活性顯著下降（P < 0.01），NO含量顯著升高（P < 0.01）；陽(yáng)和湯組與陽(yáng)性對(duì)照組SOD含量明顯高于模型對(duì)照組（P < 0.05），NO含量明顯低于模型對(duì)照組

（P < 0.05）；陽(yáng)和湯組與陽(yáng)性對(duì)照組SOD、NO含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

表2 各組關(guān)節(jié)液中SOD和NO的含量比較

組別 動(dòng)物數(shù)

（只） SOD

（μg·mL-1） NO

（μmol·L-1）

空白對(duì)照組 6 71.74±1.93 55.84±2.78

模型對(duì)照組 6 52.78±1.751） 87.89±2.261）

陽(yáng)和湯組 6 63.54±0.282） 74.21±0.442）

陽(yáng)性對(duì)照組 6 64.57±1.342）3） 73.67±0.982）3）

注 與空白對(duì)照組比較，1）P < 0.01；與模型對(duì)照組比較，2）P < 0.05；與陽(yáng)和湯組比較，3）P > 0.05

4 討 論

目前，OA發(fā)病機(jī)制尚未十分明確，隨著對(duì)OA研究的不斷深入，在分子水平上對(duì)本病有了新的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子與之有著密切的聯(lián)系，在OA發(fā)病過程中起著重要作用。NO是一種不穩(wěn)定的自由基，是在一氧化氮合酶（NOS）的作用下由L-精氨酸合成而來。NOS有組織型（cNOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）2種形式，在細(xì)胞因子的作用下，一般以iNOS為主。OA時(shí)，滑膜中豐富的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等在炎性細(xì)胞因子作用下就會(huì)激活軟骨母細(xì)胞中的NOS而產(chǎn)生大量NO。高濃度NO一方面抑制軟骨細(xì)胞增殖，使軟骨細(xì)胞修復(fù)能力低下；另一方面還促進(jìn)軟骨細(xì)胞糖酵解，產(chǎn)生ATP，使細(xì)胞外基質(zhì)合成減少，無法承載正常的負(fù)荷，從而加速軟骨破壞[9-10]。在OA患者及動(dòng)物模型的關(guān)節(jié)中誘導(dǎo)型氮氧化物合酶高頻率表達(dá)，關(guān)節(jié)液及血清NO水平升高，從而抑制膠原蛋白和蛋白多糖合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致軟骨退行性變和滑膜炎癥[11]。同時(shí)，近年來的研究表明，氧化應(yīng)激以及由此而產(chǎn)生的氧自由基，在OA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。人體自由基防御系統(tǒng)可將機(jī)體代謝所產(chǎn)生的自由基及時(shí)清除[12]，而OA病理狀態(tài)下氧自由基含量增高，過量的氧自由基可抑制軟骨細(xì)胞的增殖，抑制軟骨基質(zhì)蛋白多糖和膠原的合成，加速軟骨基質(zhì)降解，引起軟骨細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致軟骨損傷[13]。SOD是一種清除超氧陰離子自由基的重要抗氧化酶，使脂質(zhì)過氧化反應(yīng)得到抑制，從而保護(hù)滑膜和軟骨細(xì)胞免受

損傷[14]。

可見，軟骨細(xì)胞的凋亡與NO水平升高相關(guān)。軟骨細(xì)胞作為膝關(guān)節(jié)軟骨中的唯一細(xì)胞，抑制NO的產(chǎn)生或升高SOD均可抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，從而抑制關(guān)節(jié)軟骨的破壞，延緩OA的發(fā)病進(jìn)程。

OA多發(fā)于年高、體肥之人，體肥之人素體多痰，機(jī)制多為年老久病，肝腎虧虛，筋脈失于濡養(yǎng)，感受風(fēng)寒濕之邪，寒濕痰瘀乘襲，氣滯血瘀，寒痰、瘀血互結(jié)，痹阻筋骨，瘀阻脈絡(luò)而成，屬“本虛標(biāo)實(shí)”之證。陽(yáng)和湯中地黃溫補(bǔ)營(yíng)血，補(bǔ)腎填精；鹿角膠補(bǔ)腎助陽(yáng)，益精血，強(qiáng)筋骨，二者共為君藥。肉桂、炮姜炭溫陽(yáng)氣，散寒凝，通經(jīng)脈，暢血行，為臣藥。白芥子溫化寒痰，通絡(luò)散結(jié)；麻黃宣通經(jīng)絡(luò)，開散寒凝，為佐藥。諸藥合用，共奏溫陽(yáng)散寒、溫補(bǔ)營(yíng)血、溫化寒痰、通滯之功效。臨床研究發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)和湯治療膝OA取得了較好的療效[15]。筋骨痛消丸是根據(jù)平樂正骨驗(yàn)方研制而成的中藥制劑，藥物組成包括丹參、香附、桂枝、白芍、牛膝等，具有活血行氣、溫經(jīng)通絡(luò)、消腫止痛的作用，臨床已廣泛推廣運(yùn)用[16]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，陽(yáng)和湯能有效提高兔膝OA關(guān)節(jié)液中SOD的表達(dá)水平，從而減輕超氧自由基及其代謝產(chǎn)物對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的損傷；且通過降低其炎癥因子NO的含量，從而保護(hù)軟骨細(xì)胞及基質(zhì)，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的進(jìn)展，達(dá)到治療OA的作用。但其具體的分子調(diào)控機(jī)制，有待于更深入的實(shí)驗(yàn)研究。

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收稿日期：2015-06-10；修回日期：2015-07-27