李惠華　劉小英　常強(qiáng)　王偉　姚德恒　蘇明華

摘 要 以枇杷懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)量及熊果酸（UA）的含量為考察指標(biāo)，從蔗糖濃度、裝液量、pH值、接種量、溫度、光照強(qiáng)度、搖床轉(zhuǎn)速、激素等開(kāi)展培養(yǎng)參數(shù)的篩選。結(jié)果表明：接種量8 g/100 mL，pH6.0，蔗糖30 g/L，25 ℃，白熾燈400 lx，轉(zhuǎn)速130 r/min，裝液量130 mL/250 mL，MS+NAA 0.5 mg/L，15 d收獲，細(xì)胞鮮重是起始的3.577倍，UA含量為34.993 mg/g DW，是自然界枇杷葉的約3.5倍。

關(guān)鍵詞 枇杷；熊果酸；細(xì)胞懸浮培養(yǎng)

中圖分類號(hào) S667.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Ursolic acid（UA）is an activate component found in loquat and it has high economic value. The traditional UA extraction methods has limitations. A novel approach of producing UA using loquat cell suspension culture technique would have a significant benefit theoretically and practically. Different culture conditions on cell growth and UA accumulation in loquat cells， including sucrose concentration， plant growth regulators， pH， media volume， inoculums quantity， temperature， light intensity and shaking speed were investigated. The results showed that the weight of fresh cell were 3.577 times under optimal protocol after harvesting for 20 days when compared with the initial inoculums， and the UA content obtained reached 34.993 mg/g DW（Dry weight）. The optimal protocol was executed by transferring 8 g/100 mL of initial inoculums to a 130 mL liquid medium containing 30 g/L of carbon source， 0.5 mg/L plant hormone 1-Naphthaleneacetic acid（NAA）with pH6.0. Then loquat cell suspension was kept in a 25 ℃ shaker with 400 lx light intensity and shaking at 130 r/min for 15 days. The reulsts would provide foundations for future industrialized extracting UA from loquats in a large scale.

Key words Eriobotrya japonica L.； Ursolic acid； Cell suspension culture

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.011

枇杷（Eriobotrya japonica L.）為薔薇科（Rosaceae）枇杷屬植物，葉、花、果等都是傳統(tǒng)中藥，枇杷葉中富含有三萜酸等生物活性物質(zhì)，其中以熊果酸（Ursolic acid，簡(jiǎn)稱UA）為主要藥用成分，被證明具有廣泛的生物活性：抗癌[1]，抗氧化[2]，抗抑郁[3]，保護(hù)神經(jīng)[4]，治療糖尿病[5]，是高價(jià)值的天然藥物和化妝品原料。

天然植物中UA的含量低（每克干重植物中含有：枇杷葉9.987 mg，車前3.164 mg，女貞3.401 mg）[6]，生產(chǎn)上多以成熟枇杷葉，用有機(jī)溶劑提取，存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高等局限性[7-9]。因此，開(kāi)辟新的UA提取途徑十分必要。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)途徑生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物是目前中藥生產(chǎn)中重要的技術(shù)路線[5，10-11]，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般不含或少含色素、脂質(zhì)等，在提取分離方面具有更便捷經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)。此外，良好的植物細(xì)胞懸浮細(xì)胞系也被廣泛用于植物生物轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合、細(xì)胞代謝、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等研究[10-11]。Ho等[12]通過(guò)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)調(diào)控其總?cè)坪?，并?jīng)過(guò)體外小鼠試驗(yàn)表明細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)糖尿病、高血脂有抑制作用[13]。但UA作為生產(chǎn)上枇杷葉提取加工中最重要的目標(biāo)產(chǎn)物，以枇杷UA為目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，有針對(duì)性地研究枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)參數(shù)與UA產(chǎn)量的關(guān)系少見(jiàn)報(bào)道。本研究擬在已有枇杷適合懸浮培養(yǎng)愈傷組織的基礎(chǔ)上[14]，開(kāi)展細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)枇杷UA的研究。對(duì)蔗糖濃度、裝液量、pH值、接種量、溫度、光照強(qiáng)度、搖床轉(zhuǎn)速、激素等培養(yǎng)參數(shù)進(jìn)行篩選，盡可能提高UA的含量，為今后枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)提取UA規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為枇杷UA的調(diào)控機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

適合枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織建立自早鐘6號(hào)幼胚，具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。將上述愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)，于100 mL培養(yǎng)液/250 mL容量的三角錐瓶中，以MS培養(yǎng)液附加2，4-D（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸）1 mg/L，KT（6-Furfurylamino-purine，6-糠基氨基嘌呤）0.5 mg/L，蔗糖2%，pH5.8，轉(zhuǎn)速110 r/min，黑暗培養(yǎng)，長(zhǎng)期繼代保存，作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)起始材料的制備 每次試驗(yàn)的起始材料，在適合的滅菌容器中充分混勻，用移液器吸取適量體積的混合材料加入到培養(yǎng)液中。

1.2.2 培養(yǎng)條件的篩選 為了確定最佳的培養(yǎng)條件及參數(shù)，以1.1中培養(yǎng)液及培養(yǎng)條件為初始，順序進(jìn)行了蔗糖濃度、裝液量、pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度、搖床轉(zhuǎn)速、激素（生長(zhǎng)素、分裂素、生長(zhǎng)素與分裂素的組合）的不同梯度試驗(yàn)，前一個(gè)因子的梯度試驗(yàn)確定的最佳參數(shù)應(yīng)用到后一個(gè)因子的梯度試驗(yàn)中。濃度范圍通過(guò)預(yù)試驗(yàn)得以確定。①蔗糖的濃度梯度為10、15、20、25、30、35 g/L，對(duì)照為20 g/L。②裝液量：250 mL的三角錐瓶分別裝入40、70、100、130、160、190 mL的培養(yǎng)液（新培養(yǎng)液與起始接入的培養(yǎng)材料的比例為1 ∶ 1，即確保試驗(yàn)處理的細(xì)胞濃度是均一的），對(duì)照為100 mL。③pH值：4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，對(duì)照為5.8。④接種量：每100 mL中分別為2、4、6、8、10、12 g。⑤溫度：15、20、25、30、35、40 ℃，對(duì)照為25 ℃。⑥白熾燈光強(qiáng)設(shè)為0、400、1 000、2 000、4 000 lx，對(duì)照為0 lx。⑦往復(fù)式搖床轉(zhuǎn)速：50、70、90、110、130、150、170 r/min，對(duì)照為110 r/min。⑧生長(zhǎng)素2，4-D、NAA（1-naphthlcetic acid，a-萘乙酸）、IBA（Indole-3-Butytric acid，3-吲哚丁酸）設(shè)為0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/L，分裂素6-BA（6-Benzylaminopurine，6-芐氨基腺嘌呤）、KT設(shè)為0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L，對(duì)照為不添加激素。⑨在⑧中篩選到的生長(zhǎng)素NAA和分裂素KT，梯度組合：NAA 0.5、1.0、2.0 mg/L與KT 2.0 、4.0、6.0 mg/L分別組合，共9個(gè)組合，對(duì)照為不添加激素。

1.2.3 項(xiàng)目測(cè)定 細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定：培養(yǎng)材料過(guò)濾收集，并用濾紙吸干水份，測(cè)定鮮重?？疾熘笜?biāo)：鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)=收獲時(shí)100 mL細(xì)胞鮮重/起始100 mL材料的鮮重。

UA的提取及測(cè)定：測(cè)量完鮮重的細(xì)胞于50 ℃烘箱干燥至恒重，超聲波提取，高效液相色譜測(cè)定，標(biāo)樣購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110742-201220。

收獲UA總量測(cè)定：（細(xì)胞鮮重/10）g×UA的含量mg/g DW，10為細(xì)胞鮮重與干重的折算系數(shù)，由預(yù)試驗(yàn)確定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

每個(gè)試驗(yàn)3次生物學(xué)重復(fù)。數(shù)據(jù)采用SPSS18.0軟件進(jìn)行生統(tǒng)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Duncan法進(jìn)行多重比較，表示為3次重復(fù)的平均值±SE。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖濃度對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響

蔗糖屬于碳源的一種。在固體培養(yǎng)的枇杷愈傷組織偏好蔗糖[15-18]，在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)著重確定適合枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的蔗糖濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。培養(yǎng)3 d，10 g/L的處理首先發(fā)生褐變，培養(yǎng)5 d，15 g/L的處理發(fā)生褐變，可見(jiàn)較低濃度的蔗糖濃度不能滿足細(xì)胞快速分裂生長(zhǎng)的需求。30 g/L的處理鮮重是起始的3.309倍，顯著高于其他處理，最適宜枇杷懸浮細(xì)胞的分裂增殖。同時(shí)，25 g/L時(shí)UA含量最高，是初始材料的1.194倍，是對(duì)照的1.142倍，與其他處理UA含量的差異顯著。其次為35、30 g/L，此兩者之間無(wú)顯著性差異。綜上，以收獲的UA總量及培養(yǎng)液蔗糖成本考慮，30 g/L為最佳蔗糖濃度。

2.2 裝液量對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響

裝液量對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響見(jiàn)表2，100 mL處理，鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)最大，為最初鮮重的4.091倍，最適宜枇杷懸浮細(xì)胞的增殖。液體量太少（40 mL），細(xì)胞生長(zhǎng)空間有限，液體量太多（160、190 mL），培養(yǎng)液無(wú)法保持一定的振幅，影響細(xì)胞養(yǎng)分的傳導(dǎo)及溶氧，均不適宜枇杷懸浮細(xì)胞的增殖。UA含量，裝液量100 mL是最低的，裝液量40、130 mL時(shí)為較佳。以總收獲UA總量為衡量指標(biāo)，130 mL/250 mL為最佳的裝液量體積。

2.3 pH值對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響

pH值對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響見(jiàn)表3，鮮重的生長(zhǎng)倍數(shù)在pH6.0達(dá)到最大值，是起始材料的3.617倍，與對(duì)照pH5.8（液體繼代培養(yǎng)的pH）沒(méi)有顯著性差異，與其他處理有顯著性差異。而在pH4.0、4.5及6.5時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)較差，可知弱酸性培養(yǎng)液較適宜枇杷細(xì)胞的生長(zhǎng)。UA的累積，在pH4.0～6.5區(qū)間均呈現(xiàn)了下降-上升-下降的趨勢(shì)，pH6.0時(shí)，UA含量為最高值，也最適合細(xì)胞生長(zhǎng)。pH4.0時(shí)，UA的含量也較高，UA在植物中主要是以游離態(tài)或糖苷鍵的形式存在[19]，可能在一定的酸性條件下有利于糖苷鍵的分解。綜上，pH6.0為最適的pH值，此時(shí)細(xì)胞增殖快，UA含量最高。

2.4 接種量對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響

接種量對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響見(jiàn)表4，在考察接種量的影響時(shí)，當(dāng)接種量太小的時(shí)候（2 g），懸浮細(xì)胞活力較低，生長(zhǎng)緩慢。接種量過(guò)大時(shí)（12 g），細(xì)胞由于生長(zhǎng)空間有限、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給不足，72 h出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，在懸浮培養(yǎng)后期大量死亡。接種量為4、6、8 g時(shí)，鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)較高，這3個(gè)處理之間不存在顯著差異，與其他處理均存在顯著性差異；接種量為8、12 g時(shí)，UA含量為試驗(yàn)中較佳，這2個(gè)處理之間無(wú)顯著差異，與其他處理均存在顯著性差異。細(xì)胞的生長(zhǎng)與UA的累積并不一致，接種量為12 g的處理，72 h褐變明顯，在收獲期細(xì)胞大量死亡，但UA的累積卻是最高的。綜上，試驗(yàn)結(jié)果表明8 g/100 mL的接種量最適宜枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，細(xì)胞增殖最快，UA含量最高。

2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響見(jiàn)表5，溫度40 ℃時(shí)，枇杷懸浮細(xì)胞受到嚴(yán)重的熱脅迫，48 h內(nèi)，枇杷懸浮細(xì)胞由嫩黃色轉(zhuǎn)為褐色且死亡，在溫度15 ℃到溫度35 ℃區(qū)間內(nèi)，枇杷懸浮細(xì)胞較起始對(duì)照均有增長(zhǎng)，25 ℃時(shí)達(dá)到最大的生長(zhǎng)量，為起始材料的6.081倍，與其他處理有顯著的差異；20、30 ℃細(xì)胞的生長(zhǎng)情況次之，兩者之間沒(méi)有顯著性差異。UA含量在35、15 ℃出現(xiàn)較高值，分別為對(duì)照的1.710倍和1.629倍，20～30 ℃之間，UA含量均高于對(duì)照，20、25 ℃兩處理間，UA的含量沒(méi)有顯著差異。以總收獲的UA質(zhì)量為衡量標(biāo)準(zhǔn)，枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)最適宜的溫度為25 ℃。

2.6 光照強(qiáng)度對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響

光照強(qiáng)度對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響，以白熾燈光照強(qiáng)度作為考察因子，光照強(qiáng)度對(duì)鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)的影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)（見(jiàn)表6）。光照4 000 lx時(shí)最不適宜細(xì)胞的增殖及UA的積累。光照強(qiáng)度為400 lx時(shí)，枇杷懸浮細(xì)胞的鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)、UA含量最高，分別為起始的4.423倍、1.063倍，與其他處理差異顯著。因而白熾燈光照強(qiáng)度400 lx最適宜枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)UA的積累。

2.7 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響見(jiàn)表7，鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)及UA含量在130 r/min時(shí)均達(dá)到了最大值，此時(shí)細(xì)胞增殖速度最快，為起始細(xì)胞的6.180倍，UA含量為對(duì)照的1.138倍。50、70 r/min不適宜枇杷懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)速過(guò)低，細(xì)胞內(nèi)通氣狀態(tài)差導(dǎo)致細(xì)胞貼壁現(xiàn)象嚴(yán)重，部分細(xì)胞死亡，細(xì)胞鮮重生長(zhǎng)情況不及對(duì)照。150、170 r/min時(shí)，細(xì)胞受強(qiáng)大的剪切力作用，細(xì)胞部分破碎，也不利于細(xì)胞的增殖。轉(zhuǎn)速50 r/min時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最差，UA含量的積累卻僅次于最佳轉(zhuǎn)速時(shí)期（130 r/min）。綜上，枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)應(yīng)以轉(zhuǎn)速130 r/min最適宜。

2.8 激素對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響

2.8.1 生長(zhǎng)素對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響 考察生長(zhǎng)素對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響見(jiàn)表8，與起始材料相比，處理后細(xì)胞生長(zhǎng)倍數(shù)及UA含量生長(zhǎng)倍數(shù)分別為（Naphthaleneacetic acid，NAA 3.742倍，4.014倍；2，4-D 2.332倍，1.486倍；IBA 1.427倍，1.196倍），與對(duì)照相比，（NAA 3.994倍，3.304倍；2，4-D 2.332倍，1.218倍；IBA 1.534倍，0.982倍）。生長(zhǎng)素的處理使起始材料有一定的增長(zhǎng)及UA的累積，生長(zhǎng)素種類的效果NAA>2，4-D>IBA。

隨NAA濃度的增加，枇杷懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，收獲時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)均達(dá)到起始材料的3.5倍以上，NAA1.0，NAA2.0，NAA4.0枇杷細(xì)胞增殖速度較快，3個(gè)處理間沒(méi)有顯著性差異，NAA6.0時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)速度次之，NAA0.5再次之，但總體差距不大。而NAA濃度對(duì)UA含量的影響較大，隨著NAA濃度的增加，基本呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，以NAA0.5最適宜UA的積累，是對(duì)照的3.964倍，與其他處理存在顯著差異。

隨著2，4-D添加濃度的增加，枇杷懸浮細(xì)胞的鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)逐漸降低，可見(jiàn)低濃度的2，4-D較適宜枇杷懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。UA含量的積累，在2，4-D0.5-4.0時(shí)，UA含量逐漸下降，2，4-D4.0 UA含量低于對(duì)照，但在2，4-D6.0時(shí)，UA含量又出現(xiàn)一定幅度增長(zhǎng)。

IBA不適宜枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)液整體較灰暗。從表8可知，隨著IBA濃度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)倍數(shù)也相應(yīng)增加，IBA6.0的細(xì)胞生長(zhǎng)倍數(shù)最大，為初始的1.678倍，但效果不如2，4-D及NAA，遠(yuǎn)小于NAA2.0（3.809倍），IBA1.0的UA含量最高，僅是初始的1.245倍，遠(yuǎn)小于NAA0.5的4.829倍。因而，IBA是試驗(yàn)中最不適宜枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的生長(zhǎng)素。

綜上，3種生長(zhǎng)素對(duì)枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)鮮重生長(zhǎng)影響和UA含量的影響并不一致，從獲得UA總量角度考慮，NAA0.5為最適宜的枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所需的生長(zhǎng)素濃度。

2.8.2 分裂素對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響 分裂素對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響見(jiàn)表9，與起始材料相比，處理后細(xì)胞生長(zhǎng)倍數(shù)及UA含量生長(zhǎng)倍數(shù)分別為（BA 1.158倍，1.932倍；KT 1.557倍，3.123倍），與對(duì)照相比為（BA 1.227倍，2.374倍；KT 1.649倍，3.838倍），分裂素的處理使起始材料有一定的生長(zhǎng)和UA的累積，分裂素種類效果為KT>BA。

枇杷細(xì)胞鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)隨著KT濃度的增大而增加，各處理顯著高于對(duì)照，KT4.0時(shí)，枇杷細(xì)胞懸浮增殖最快，是對(duì)照的1.936倍。UA的含量，隨KT濃度變化，含量先小幅下降而后逐漸增大，各處理均顯著高于對(duì)照及起始材料。KT4.0時(shí)，達(dá)到最大值，即分別為初始材料及對(duì)照的3.526倍、4.333倍。因而，高濃度的分裂素KT較適用于枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。是否超出試驗(yàn)范圍的更高的KT濃度更適合，本試驗(yàn)中有進(jìn)一步的激素組合及激素橫向比較分析。

枇杷懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)隨著B(niǎo)A濃度的增大而增加，在BA濃度為0.25～0.5 mg/L較低范圍，細(xì)胞的鮮重較起始材料有所下降，與對(duì)照相比沒(méi)有顯著性差異。在濃度1.0 mg/L以上時(shí)，細(xì)胞開(kāi)始增殖，在本試驗(yàn)范圍內(nèi)，以BA4.0的增殖速度最快，為處理前的1.565倍，是對(duì)照的1.605倍。UA含量以BA1.0為較佳，在此濃度下，UA含量分別為處理前的2.083倍，為對(duì)照的2.177倍，與BA其他濃度處理差異顯著。

2.8.3 生長(zhǎng)素與分裂素組合對(duì)懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量及UA累積的影響 在激素單因子試驗(yàn)中篩選到的生長(zhǎng)素NAA最適濃度0.5，分裂素KT最適濃度4.0，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行組合試驗(yàn)，試驗(yàn)組合及結(jié)果見(jiàn)表10。各處理的細(xì)胞鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)和UA含量均顯著高于對(duì)照，但UA含量?jī)H有處理NAA0.5/KT2.0顯著高于起始材料。當(dāng)NAA濃度為0.5、2.0 mg/L時(shí)，枇杷鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)無(wú)較大差異；NAA濃度為1.0時(shí)， 2.0 mg/L的處理細(xì)胞鮮重明顯高于4.0、6.0 mg/L。在NAA濃度一定時(shí)（即NAA0.5、NAA1.0、NAA2.0），UA的含量隨著KT濃度的增加而下降。綜上， NAA1.0/KT2.0為最適宜枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)及UA累積。

以收獲的UA總量為衡量標(biāo)準(zhǔn)，橫向比較激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及UA累積的影響的表8～10發(fā)現(xiàn)，NAA0.5>2，4-D0.5>NAA1.0/KT2.0。因而，激素單獨(dú)作用效果明顯優(yōu)于激素組合。

3 討論與結(jié)論

3.1 懸浮脅迫培養(yǎng)與次生代謝物含量

在本研究中，脅迫產(chǎn)生后一般出現(xiàn)細(xì)胞鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)降低即細(xì)胞生長(zhǎng)減緩，UA含量增加現(xiàn)象。如考察接種量與UA含量聯(lián)系時(shí)，接種量12 g時(shí)，72 h褐變明顯，在收獲期細(xì)胞大量死亡，但UA含量卻是最高；考察裝液量與UA含量聯(lián)系時(shí)，裝液量40 mL較佳，但此處理的細(xì)胞生長(zhǎng)情況僅中等水平；自然狀態(tài)下，枇杷植株的最適合生長(zhǎng)溫度為25 ℃，年均溫度15 ℃以上能生長(zhǎng)，35 ℃以上容易產(chǎn)生日灼傷害，考察溫度與UA含量聯(lián)系時(shí)，UA含量在35、15 ℃出現(xiàn)較高值；在考察轉(zhuǎn)速時(shí)，轉(zhuǎn)速50 r/min的處理細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最差，UA含量的積累卻僅次于最佳轉(zhuǎn)速時(shí)期（130 r/min）?？赡苡捎谏L(zhǎng)空間有限、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給不足，細(xì)胞處于類似脅迫狀態(tài)，此時(shí)的次生代謝途徑大量開(kāi)啟，UA增加累積以更好地適應(yīng)環(huán)境。

在其他研究中也有類似報(bào)道。如：在非最適生長(zhǎng)溫度下，玉米向光面的葉片中積累花青素，以避免光抑制造成的傷害[20]。滲透脅迫下多種植物在體內(nèi)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)甜菜堿[21]。茉莉酸甲酯和水楊酸誘導(dǎo)的氧脅迫增加了人參根細(xì)胞懸浮液中酚的含量[22]。

今后，可在本研究的基礎(chǔ)上，于枇杷細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中期或后期（當(dāng)細(xì)胞增長(zhǎng)到一定的程度），適時(shí)設(shè)計(jì)適度的脅迫促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物UA的累積，如低溫15 ℃或高溫35 ℃；低轉(zhuǎn)速50 r/min；高濃度的CO2等。同時(shí)UA屬于五環(huán)三萜化合物，此類化合物在生物體內(nèi)的代謝途徑也已有一定的研究，進(jìn)行脅迫與UA研究時(shí)可以同時(shí)關(guān)注代謝途徑中的關(guān)鍵性的酶，進(jìn)行相關(guān)機(jī)理的探索。

3.2 培養(yǎng)因子與次生代謝物含量

本研究順序考察了蔗糖濃度、裝液量、pH值、接種量、培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度、搖床轉(zhuǎn)速、激素對(duì)枇杷懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)及UA含量的影響，在確定前一個(gè)因子的最佳水平后應(yīng)用到后一因子的試驗(yàn)中，由此逐步獲得各個(gè)影響因子的最佳值，經(jīng)調(diào)控UA含量逐漸升高，最終平均值為23.609 mg/g DW（所有激素處理樣品的平均值），為所有因子中最高，但不加激素的對(duì)照UA的含量?jī)H為8.181 mg/g DW。由此可以看出，激素是所涉及試驗(yàn)因子中最重要的因子，且激素單獨(dú)使用的效果好于激素組合。

激素對(duì)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的形成具有特殊的調(diào)節(jié)作用[23-25]。Villarreal等[26]發(fā)現(xiàn)多裂水茄細(xì)胞在含有2 mg/L 2，4-D和2 mg/L KT 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后，皂角苷含量達(dá)到14 mg/g，是自然植株的50倍。本研究中激素的調(diào)控效果最好，但單獨(dú)使用時(shí)，NAA 0.5> 2，4-D 0.5>激素組合NAA1.0/KT2.0?？紤]到植物激素之間存在拮抗作用[27]，在設(shè)計(jì)試驗(yàn)時(shí)不要忽略單激素使用效果可能優(yōu)于激素組合。

3.3 培養(yǎng)因子調(diào)控的效果及意義

枇杷葉UA含量相對(duì)其他植物較高[6]，因此生產(chǎn)中也是采用枇杷葉片提取UA。通過(guò)本試驗(yàn)枇杷細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，其最佳調(diào)控為：接種量8 g/100 mL，pH6.0，碳源濃度30 g/L，溫度25 ℃，白熾燈400 lx，轉(zhuǎn)速130 r/min，裝液量130 mL/250 mL，MS培養(yǎng)液中添加NAA 0.5 mg/L。15 d收獲時(shí)，細(xì)胞的鮮重生長(zhǎng)倍數(shù)達(dá)到起始材料的3.577倍，每克干重UA的含量為34.993 mg，是自然生長(zhǎng)的枇杷葉的約3.5倍。

Ho等[12]在枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)調(diào)控三萜類化合物的研究中表明：在MS培養(yǎng)基中添加2.5 mg/L 6-BA，1 mg/L NAA和30 g/L蔗糖，（25±2）℃黑暗培養(yǎng)30 d，總?cè)坪繛椋?51.54±12.58）mg/g DW，其中UA的含量是15.56 mg/g DW。本研究側(cè)重于其中一種三萜類化合物——UA，培養(yǎng)參數(shù)與Ho等[12]在光照強(qiáng)度，調(diào)控激素的種類上有較大的區(qū)別：弱光更適合UA的累積，單激素低劑量的調(diào)控優(yōu)于激素的組合，同時(shí)UA的含量是Ho等[12]UA含量的2.25倍。鑒于研究目的是收集次生代謝產(chǎn)物，在優(yōu)先考慮細(xì)胞生長(zhǎng)佳及次生產(chǎn)物收獲量大基礎(chǔ)上，本著對(duì)產(chǎn)物安全性的考慮，本研究在激素的選擇上以單個(gè)激素更小劑量更具優(yōu)勢(shì)。同時(shí)為今后通過(guò)枇杷細(xì)胞懸浮培養(yǎng)規(guī)?；a(chǎn)UA提供參考，為UA調(diào)控機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] YU Y X， GU Z L， YIN J L， et al. Ursolic acid induces human hepatoma cell line SMMC-7721 apoptosis via p53-dependent pathway[J]. Chin Med J， 2010， 123： 1 915-1 923.

[2] Shih-Jei Tsai， M-C Yin. Antioxidative and anti-inflammatory protection of oleanolic acid and ursolic acid in PC12 cells[J]. J Food Sci， 2008， 73（7）： 174-178.

[3] Machado D G， Neis V B， Balen G O， et al. Antidepressant-like effect of ursolic acid isolated from Rosmarinus officinalis L. in mice： evidence for the involvement of the dopaminergic system[J]. Pharmacol Biochem Behav， 2012， 103（2）： 204-211.

[4] Lu J， Zheng Y L， Wu D M， et al. Ursolic acid ameliorates cognition deficits and attenuates oxidative damage in the brain of senescent mice induced by D-galactose[J]. Biochem Pharmacol， 2007， 74（7）： 1 078-1 090.

[5] Jang S M， Yee S T， Choi J， et al. Ursolic acid enhances the cellular immune system and pancreatic beta-cell function in streptozotocin-induced diabetic mice fed a high-fat diet[J]. Intimmuno Pharma Col， 2009， 9（1）： 113-119.

[6] 相延英， 楊 光. 常用中藥中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志， 2004， 24（5）： 316-318.

[7] 吳 梨， 趙 偉， 楊瑞金. 從枇杷葉中分離提取熊果酸的研究進(jìn)展[J]. 北京工商大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2011， 29（6）： 50-53.

[8] 付紅軍， 彭湘蓮. 枇杷葉中熊果酸的索氏提取工藝優(yōu)化[J]. 食品與機(jī)械， 2011， 27（2）： 59-61.

[9] 張 靜， 劉 藝， 殷 飛，等.枇杷葉中熊果酸的提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)， 2007（3）： 22-24.

[10] Georgiev M I， Weber J， Maciuk A. Bioprocessing of plant cell cultures for mass production of targeted compounds[J]. Appl Microbiol Biotechnol， 2009， 83： 809-823.

[11] Mustafa N R， Winter W， Iren F， et al. Initiation， growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures[J]. Nature Protocols， 2011， 6（6）： 715-742.

[12] Ho H Y， Liang K Y， Lin W C， et al. Regulation and improvement of triterpene formation in plant cultured cells of Eriobotrya japonica Lindl[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2010， 110（5）： 588-592.

[13] Shih C C， Ciou J L， Lin C H， et al. Cell suspension culture of Eriobotrya japonica regulates the diabetic and hyperlipidemic sign of high-fat-fed mice[J]. Molecules， 2013， 18： 2 726-2 753.

[14] 李惠華， 劉小英， 王 偉， 等. 適合于懸浮培養(yǎng)的枇杷愈傷組織的誘導(dǎo)及狀態(tài)調(diào)控[J]. 亞熱帶植物科學(xué)， 2013， 42（4）： 309-313.

[15] 王家福， 劉月學(xué). 枇杷胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和保存[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2000， 29（3）： 305-310.

[16] 彭曉軍， 王永清. 枇杷胚乳愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽發(fā)生的研究[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2002， 20（3）： 228-231.

[17] 王 芳， 呂洪飛， 徐紅霞， 等. 枇杷幼葉組織培養(yǎng)與植株再生研究[J]. 生物技術(shù)通訊， 2011， 22（1）： 53-56.

[18] Li J， Wang Y， Lin L， et al. Embryogenesis and plant regeneration from anther culture in loquat（Eriobotrya japonica L.）[J]. Scientia Horticulturae， 2008， 115： 329-336.

[19] 陳 武， 熊筱娟， 李開(kāi)泉， 等. 烏索酸的化學(xué)、 藥理及臨床研究[J]. 宜春醫(yī)專學(xué)報(bào)， 2001， 13（2）： 123-126.

[20] Pietrini F， Iannelli M A， Massacci A. Anthocyan in accumulation in the illuminated surface of maize leaves enhances protection from photo-inhibitory risk s at low temperature， without further limitation to photosynthesis[J]. Plant Cell and Environment， 2002， 25： 1 251-1 259.

[21] Reda E A Moghaieb， Hirofumi Saneoka， Kounosuke Fujita. Effect of salinity on osmotic adjustment， glycinebetaine accumulation and the betaine aldehyde dehydrogenase gene expression in two halophytic plants， Salicornia europaea and Suaeda maritima[J]. Plant Science， 2004， 166（5）： 1 345-1 349.

[22] Ali M B， Hahn E J， Paek K Y. Methyl jasmonate and salicylic acid induced oxidative stress and accumulation of phenolics in Panax ginseng bioreactor root suspension cultures[J]. Molecules， 2007， 12（3）： 607-621.

[23] Maheshwari P， Songara B， Kumar S， et al. Alkaloid production in Vernonia cinerea： Callus， cell suspension and root cultures[J]. Biotechnol J， 2007， 2（8）： 1 026-1 032.

[24] Zlenko V A， Kotikov I K， Troshin L P. Efficient GA3-assisted plant regeneration from cell suspensions of three grape genotypes via somatic embryogenesis. Plant Cell[J]. Tissue and Organ Culture， 2002， 70： 295-299.

[25] Vanildo Silveira， Eny Iochevet Segal Floh， Walter H， et al. Effect of plant growth regulators on the cellular growth and levels of intracellular protein， starch and polyamines in embryogenic suspension cultures of Pinus taeda[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2004， 76（1）： 53-60.

[26] Villarreal M L， Arias C， Feria-Velasco A， et al. Cell suspension culture of Solanum chrysotrichum（Schldl.）-A Plant producing an Antifungal Spirostanol Sapon[J]. Plant Cell Tissueand Organ Culture， 1997， 50： 39-44.

[27] Steber C M， McCourt P. A Role for brassinosteroids in germination in Arabidopsis[J]. American Society of Plant Physiologists， 2001， 125： 763-769.