齊文杰等
摘要:目的 探討重癥急性胰腺炎大鼠舌組織水通道蛋白3(AQP3)的表達及大黃素的調(diào)節(jié)作用。方法 采用5%?;悄懰徕c逆行膽胰管注入制作大鼠急性重癥胰腺炎模型。將SD雄性大鼠隨機分成假手術(shù)組、模型組、大黃素組,大黃素組于造模后每日予大黃素20 mg/kg灌胃,模型組及假手術(shù)組予等量生理鹽水灌胃。造模后每日觀察大鼠精神狀態(tài)、厚膩苔出現(xiàn)情況及存活率;造模第5日后各組隨機選取8只大鼠處死,留取標(biāo)本,采用Western blot和實時定量PCR檢測舌組織AQP3蛋白及基因表達。結(jié)果 與模型組比較,大黃素組大鼠死亡率、厚膩苔發(fā)生率降低及厚膩苔發(fā)生明顯減少,AQP3蛋白及基因表達明顯降低(P<0.05)。至實驗第5日,模型組存活11只大鼠,出現(xiàn)厚膩苔5只;與假手術(shù)組比較,模型組大鼠舌組織AQP3蛋白及基因表達均明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 大黃素通過下調(diào)AQP3蛋白及基因表達,改善重癥急性胰腺炎大鼠癥狀,減少厚膩苔的發(fā)生。
關(guān)鍵詞:胰腺炎;大黃素;水通道蛋白3;基因表達;蛋白表達;大鼠
中圖分類號:R285.5 文獻標(biāo)識碼:A 文章編號:1005-5304(2015)06-0069-04
重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是臨床常見危重病之一。臨床觀察發(fā)現(xiàn),近半數(shù)表現(xiàn)為肝脾濕熱證[1]。前期研究表明,SAP大鼠在病情發(fā)展過程中可部分出現(xiàn)舌苔厚膩的“濕”象,血管通透性增高能促進厚膩苔的發(fā)生[2]。水通道蛋白3(AQP3)是與水及甘油等小分子通透性有關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白,廣泛表達于消化道上皮細胞,研究表明,AQP3異常表達可引起黏膜通透性的改變[3-4]。本研究觀察大黃素干預(yù)治療對SAP大鼠厚膩苔及舌組織AQP3表達的影響及其可能機制。
1 材料與方法
1.1 動物
SPF級雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±50)g,解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心,許可證號SCXK(軍) 2007-0004。
1.2 藥物、試劑與儀器
大黃素,昆明風(fēng)山漸醫(yī)藥研究有限公司;?;悄懰徕c,美國Amresco公司;兔抗AQP3多克隆抗體 (1∶1000),英國Abcam公司,β肌動蛋白(β-actin, 1∶1000)和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗 (1∶3000),美國Santa Cruz公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(SUNBIO),Trizol試劑(美國Invitrogen公司),cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems,美國)。Smartspec plus核酸蛋白測定儀(美國Bio-Rad公司),RT-PCR system(美國ABI公司),高速低溫離心機Sigma 3K-18(美國Sigma公司),紫外分光光度計U-2001 UV/VIS(日本東芝),凝膠成像儀及Icycler PCR儀(美國Bio-Rad公司)。
1.3 分組、造模與給藥
入選大鼠共45只,隨機分為模型組(20只)、大黃素組(15只)、假手術(shù)組(10只)。采用胰膽管逆行勻速注入?;悄懰徕c(1 mL/kg)的方法制備大鼠SAP模型[5]。大黃素組于術(shù)后即予灌胃,每次10 mg/kg,模型組和假手術(shù)組予等量生理鹽水灌胃。2次/d,連續(xù)4 d。
1.4 標(biāo)本制備
造模后第5日,每組隨機選取8只大鼠,麻醉后心臟取血,留取舌組織(舌中部接近中線位置),分別以多聚甲醛水溶液固定,液氮保存?zhèn)溆谩?/p>
1.5 指標(biāo)檢測
1.5.1 一般觀察 造模后每日觀察大鼠精神狀態(tài)、舌質(zhì)、舌苔等證象,并記錄死亡情況。
1.5.2 舌組織水通道蛋白3蛋白表達檢測 采用Western blot檢測舌組織AQP3蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明書步驟操作,根據(jù)標(biāo)準曲線計算出蛋白濃度。一抗及二抗孵育后DAB顯色、ECL曝光,并用LabWorks軟件對圖像進行灰度分析。
1.5.3 大鼠舌組織水通道蛋白3基因表達檢測 采用RT-PCR檢測舌組織中AQP3基因表達。Trizol試劑提取各組舌組織總RNA,并以紫外吸收法定量。隨后,cDNA反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書步驟操作。引物由北京賽百盛公司設(shè)計:AQP3(上游5'-ACCTCCATGGGCTTC AATTCT-3',下游5'-AGTGAAAAGGCGAGGTCCAA-3);GAPDH(上游5'-CTCAACTACATGGTCTACATGTTCCA-3',下游5'-CTTCCCATTCTCAGCCTTGACT-3')。反應(yīng)體系為20 μL,內(nèi)參照基因為大鼠GAPDH。采用相對定量2-ΔΔCt值方法分析。設(shè)定標(biāo)準對照品基因表達為1。
1.6 統(tǒng)計學(xué)方法
采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示,組間比較采用方差分析及q檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠舌苔的影響
模型組:術(shù)后大鼠現(xiàn)倦怠,聳毛,部分大鼠出現(xiàn)便溏,至第5日存活11只大鼠中出現(xiàn)厚(黃或白)膩苔5只。大黃素組:大鼠麻醉蘇醒后活動略減少,至次日活動、飲食均明顯好轉(zhuǎn),倦怠逐漸減輕,大便呈黃稀便,至第5日,大鼠共存活12只,僅2只大鼠出現(xiàn)厚(黃或白)膩苔,顯著低于模型組。表明大黃素可明顯減少SAP大鼠厚膩苔的發(fā)生。假手術(shù)組:大鼠麻醉蘇醒后活動略減少,次日開始即飲食、活動基本正常,無倦怠、聳毛,大便正常,未現(xiàn)便溏;舌苔與正常大鼠比較無明顯變化。
2.2 大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠存活率的影響
至實驗第5日,模型組大鼠存活11只(存活率為55%),大黃素組大鼠存活12只(存活率為80%),存活率明顯高于模型組,見圖1。提示大黃素可明顯改善SAP大鼠預(yù)后。
2.3 大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠舌組織水通道蛋白3蛋白表達的影響
模型組大鼠舌組織中AQP3蛋白表達明顯高于假手術(shù)組(P<0.05);與模型組比較,大黃素組AQP3蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見圖2。
2.4 大黃素對重癥急性胰腺炎大鼠舌組織水通道蛋白3基因表達的影響
與假手術(shù)組比較,模型組和大黃素組大鼠舌組織中AQP3 mRNA明顯升高(P<0.05),但2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3。
3 討論
中醫(yī)學(xué)認為,急性胰腺炎與肝、膽、脾、胃、大腸等臟腑密切相關(guān),由于飲食不節(jié)、恣食膏粱厚味、情志不暢、蛔蟲竄擾等致肝膽脾胃功能失職,濕、熱、毒、瘀蘊結(jié)中焦,氣機升降失調(diào)而致病。唐氏等[1]觀察臨床51例急性胰腺炎患者,其中17例表現(xiàn)為肝脾濕熱型,舌苔厚膩。而本實驗也發(fā)現(xiàn)SAP大鼠造模第5日厚膩苔的出現(xiàn)率明顯增多。
大黃素是從大黃中提純的蒽醌類衍生物,現(xiàn)代研究表明,大黃素具有抑酶、抑菌、導(dǎo)瀉、解除括約肌痙攣作用等[6-8]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),大黃素能明顯改善SAP大鼠胰腺病理破壞,降低血淀粉酶水平,改善預(yù)后[9]。本研究顯示,大黃素可降低SAP大鼠死亡率,對SAP的治療作用與前期研究及相關(guān)文獻報道一致[8,10]。
現(xiàn)代研究表明,濕熱證病理生理中,水濕停滯、潴溜于體內(nèi)是主要的臨床改變之一。脾胃濕熱證大鼠模型可見,濕偏重者脾臟血竇周圍內(nèi)皮細胞明顯水腫;溫病濕熱證濕重于熱動物模型舌固有層水腫明顯[11]。由此可見,水液代謝失衡在濕熱證的病理生理過程中起著重要的作用。鑒于膩苔是濕證的特征性舌苔,提示膩苔的形成與水濕停滯、潴留于體內(nèi)可能有關(guān)。
AQPs是細胞膜上的一種與水的通透性有關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白。已有研究顯示,脾胃濕熱證患者胃黏膜AQP3、AQP4基因和蛋白表達水平顯著高于正常對照組,中藥清熱化濕方可顯著降低二者的蛋白和基因表達水平[12]。本研究通過Western blot、實時定量PCR分析發(fā)現(xiàn),SAP大鼠舌組織中AQP3蛋白及基因表達均明顯升高。鑒于AQP3是一種小分子物質(zhì)通透性相關(guān)的轉(zhuǎn)運蛋白,其水平升高可增加小分子物質(zhì)的通透,引起水濕停滯,故推測AQP3與SAP大鼠濕證的發(fā)生及厚膩苔形成可能有關(guān)。
大黃能促進胃腸蠕動,防治麻痹性腸梗阻,促進腸道內(nèi)毒素排泄,保持腸道微生態(tài)平衡,并且能降低腸黏膜通透性,抑制腸道細菌及內(nèi)毒素移位等作用。我們的前期研究結(jié)果提示,AQP3參與了SAP的病理生理改變,考慮為腸黏膜通透性增高的機制之一[10];大黃素治療使AQP3蛋白及基因表達下降,可能與大黃素治療SAP時降低腸黏膜通透性有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),大黃素可明顯下調(diào)SAP大鼠舌組織AQP3的蛋白及基因表達,同時,大黃素治療后厚膩苔的發(fā)生也明顯減少,其機制可能是通過下調(diào)AQP3蛋白及基因表達,減少水的通透性,還有待進一步探討。
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(收稿日期:2014-10-10;編輯:華強)