陳文波 胡宏海 張春江 黃峰 張雪 劉倩楠 張泓

摘 要：借助平板菌落計(jì)數(shù)、變性梯度凝膠電泳分析和純種微生物分離鑒定等手段研究靜電場在白切雞貯藏過程中對微生物總數(shù)、微生物多樣性、純種微生物生長的影響，通過比較分析靜電場在純種微生物生長中的作用，揭示靜電場延長白切雞貨架期的機(jī)理。結(jié)果表明：白切雞是一種原始帶菌量比較高的產(chǎn)品，通過靜電場處理可以延長白切雞產(chǎn)品的貨架期。白切雞中的微生物以來源于產(chǎn)品原料的假單胞菌屬的微生物為主。靜電場對純種微生物生長的抑制存在種屬差異性。

關(guān)鍵詞：白切雞；變性梯度凝膠電泳；假單胞菌；靜電場；抑制作用

Influence and Mechanism of Electrostatic Field on Total Microbial Count in Chopped Cold Chicken

CHEN Wenbo， HU Honghai， ZHANG Chunjiang， HUANG Feng， ZHANG Xue，LIU Qiannan， ZHANG Hong*

（Comprehensive Key Laboratory of Agro-products Processing， Ministry of Agriculture， Institute of Agro-products Processing Science and Technology， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract： The influence of electrostatic field on total microbial count and microbial diversity in chopped cold chicken was investigated by plate count and denatured gradient gel electrophoresis （DGGE） and the growth characteristics of pure cultures of Pseudomonas isolated from chopped cold chicken were tested to reveal the mechanism of electrostatic field for extending its shelf life. The results of this study revealed chopped cold chicken itself had high microbial load and its shelf life could be prolonged by electrostatic field treatment. Pseudomonas was the dominant microbe in chopped cold chicken， which was derived from the raw materials. The inhibitory effect of electrostatic field treatment on the growth of pure cultures of Pseudomonas was species-dependent.

Key words： electrostatic field； chopped cold chicken； DGGE； Pseudomonas； inhibition

中圖分類號：TS251.55 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201506001

白切雞素有“雞中第一鮮”的美譽(yù)[1]。這是因?yàn)榘浊须u的烹制過程僅使用熱水浸燙，而不是沸水煮制。這樣的烹制方法保證了白切雞的雞肉處于熟而不爛的鮮嫩狀態(tài)，同時(shí)也增加了白切雞產(chǎn)品攜帶大量微生物的風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，由于微生物的大量存在，白切雞產(chǎn)品的貨架期都很短，不適合大規(guī)模的商業(yè)化生產(chǎn)。

為了解決食品因微生物而導(dǎo)致的貨架期過短的問題，研究人員提出了眾多新型的滅菌方法，如輻照、超聲波、高壓脈沖電場等[2-4]。與傳統(tǒng)的熱殺菌技術(shù)相比，這些新型的滅菌方法不產(chǎn)熱，可極大限度地保留滅菌對象的原有品質(zhì)，具有一定的優(yōu)勢。但是這些方法存在設(shè)備昂貴、應(yīng)用范圍較窄、安全性能較低等的特點(diǎn)。

低壓靜電場是一種新型的食品保鮮技術(shù)，它可以產(chǎn)生最高達(dá)3 000 V左右的空間電勢，借以影響置身其中的微生物等營養(yǎng)細(xì)胞的生命活力，達(dá)到食品保鮮、延長食品貨架期的目的。而且，當(dāng)前已經(jīng)開發(fā)出小巧輕便的低壓靜電壓場產(chǎn)生設(shè)備，拓寬了這種新型的食品保鮮技術(shù)的應(yīng)用范圍。然而，當(dāng)前關(guān)于這種低壓靜電場影響食品中微生物的研究相對較少，而且也缺乏這種技術(shù)在白切雞中的應(yīng)用實(shí)例。因此，本研究目的主要集中在低壓靜電場對白切雞中微生物總數(shù)及多樣性的影響上，通過純種微生物分離進(jìn)一步揭示低壓靜電場對不同微生物生長影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三黃雞（1 kg左右）、蔥、姜 市購。

平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NaCl、KH2PO4、NaOH、HCl 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DNA Marker、PCR試劑、pMD19-T Vector Systems、限制性內(nèi)切酶 寶生物（大連）工程有限公司；pGEM-T Easy Vector Systems 美國 Promega公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、質(zhì)粒連接試劑盒 美國Omega Bio-Tek公司；瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺、尿素、Tris堿、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、十二烷基硫酸鈉 生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白胨、酵母粉 英國Oxoid公司；引物合成 生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；移液器 美國Eppendorf公司；Beadbeater細(xì)胞破碎儀 美國Biospec公司；PCR儀、電泳儀、變性梯度電泳儀、凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；核酸濃度測定儀 通用（上海）有限公司；冷凍高速離心機(jī) 美國Sigma-Aldrich公司；超低溫冰箱 美國Thermo 電子儀器公司；電子天平 上海天平儀器廠；測序儀 美國ABI公司；真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋 上海華連醫(yī)療器械有限公司；空間靜電場發(fā)生器 日本Agua公司；HR2105絞肉機(jī) 荷蘭Philips公司。

1.3 方法

1.3.1 白切雞的制作

白切雞的制作方法參照陳文波等[1]的方法。

1.3.2 白切雞樣品的貯存與電場處理

白切雞樣品的貯存方法參照Novak等[5]的方法，并略加修改。具體的操作方法如下：取白切雞的雞腿肉和雞胸肉放入絞肉機(jī)中，以最高速率（12 000 r/min）打碎1 min。然后，取50 g放入無菌袋中并置于裝有空間靜電場和未安裝空間靜電場的4 ℃的冰箱中進(jìn)行貯藏。為了避免環(huán)境中微生物的染污，白切雞樣品的準(zhǔn)備過程均在超凈工作臺中進(jìn)行?？臻g靜電場的強(qiáng)度控制在600～1 000 V之間。

1.3.3 細(xì)菌總數(shù)的測定

白切雞中細(xì)菌總數(shù)的測定方法參照Chen Jinru等[6]的方法及GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[7]，并略做修改。具體的操作方法如下：取貯藏不同時(shí)間的白切雞樣品5 g置于45 mL滅菌生理鹽水中并充分剪碎，于振蕩器上持續(xù)振蕩混勻15 min后按體積比1：10的比例進(jìn)行系列稀釋。最后選擇適合稀釋梯度的樣品懸液進(jìn)行平板涂布并置于37 ℃的培養(yǎng)箱中保溫24～48 h。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)平板上細(xì)菌克隆的總數(shù)并計(jì)算原始樣品中的微生物總數(shù)（以lg（CFU/g）表示）。

1.3.4 白切雞中細(xì)菌總DNA的提取

在生物安全柜內(nèi)用無菌剪刀剪取肉樣，放在無菌的平板內(nèi)準(zhǔn)確稱量25 g，剪碎肉樣置于80 mL無菌離心管內(nèi)，加入50 mL無菌雙蒸水，3 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入80 mL無菌離心管內(nèi)，12 000 r/min離心10 min，棄掉上清，用1 mL無菌水清洗菌體沉淀，將菌體沉淀轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管內(nèi)，繼續(xù)12 000 r/min離心5 min，棄上清，菌體沉淀用于提取DNA。

菌體總DNA的提取方法按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提供的方法進(jìn)行。

1.3.5 目的片段的PCR擴(kuò)增

對細(xì)菌的16S rDNA的V6～V8 區(qū)片段進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。上游引物為帶有GC夾子的U968，下游引物是L141。U968-GC夾子為：5 -CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3 。下游引物L(fēng)141為：5 -CGG TGT GTA CAA GAC CC-3 。上述引物均由生工生物（上海）技術(shù)有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為：10×PCR緩沖液5 μL；dNTP（2.5 mmol/L）4 μL；ExTaq（5 U/μL）0.5 μL；U968-GC（20 μmol/L）0.5 μL；L141（20 μmol/L）0.5μL；模板DNA 100 ng；補(bǔ)充雙蒸水至50 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸30 s、30個循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物采用美國Axygen公司DNA Gel Extraction Kit純化回收。

1.3.6 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）分析

取10 μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。采用變性梯度為35%～55%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠（化學(xué)變性劑為100%尿素7 mol/L和體積分?jǐn)?shù)40%的去離子甲酰胺）在1×TAE緩沖液中200 V預(yù)電泳8 min，隨后85 V電泳16 h。DGGE完畢后，采用銀染法進(jìn)行染色。

1.3.7 DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的回收與測序

用無菌的手術(shù)刀切下待回收DGGE條帶，采用美國Omega 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶。

以2 μL回收產(chǎn)物為模板，U968/L141為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為：10×PCR緩沖液5 μL；dNTP（2.5 mmol/L）4 μL；rTaq酶（5 U/μL）0.5 μL；U968（20 μmol/L）0.5 μL；L141（20 μmol/L）0.5 μL；模板DNA 100 ng；補(bǔ)雙蒸水至50 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸30 s、30個循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。

將重新擴(kuò)增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到Pmd18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，進(jìn)行序列測定。

1.3.8 白切雞中可培養(yǎng)兼性嗜冷微生物的分離

取5 g腐敗的白切雞樣品加入45 mL無菌的生理鹽水中，用無菌剪刀將其中的雞肉樣品剪碎后制備10倍稀釋的樣品懸液。然后對該樣品懸液進(jìn)行系列梯度稀釋之后，選擇適合濃度的稀釋液進(jìn)行平板涂布并于4 ℃冰箱中倒置培養(yǎng)7～10 d。待平板上的克隆生長出之后，對細(xì)菌總數(shù)在50 CFU/mL左右的平板上的全部克隆進(jìn)行劃線純化。純化的菌株的鑒定通過16S rDNA序列的測定進(jìn)行。

1.3.9 靜電場對純種微生物生長速度的影響

靜電場對純種微生物生長速度的影響，主要參考Ercolini等[8]的方法并略做修改。將純種微生物克隆制備成細(xì)胞濃度約為1 000 CFU/mL的懸液，取100 μL懸液涂布平板。每個克隆稀釋液制備6 個平板，處理組和對照組各使用3 個平板。通過觀察平板上的生物量評價(jià)微生物的生長速率。

1.4 數(shù)據(jù)分析及作圖

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析主要通過Microsoft Excel 2013及SPSS 19.0進(jìn)行；數(shù)據(jù)作圖使用Origin 9.0和Sigmaplot 12.0軟件；實(shí)驗(yàn)照片的處理使用Adobe Photoshop CS6進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 電場對白切雞中微生物總數(shù)的影響

靜電場可以明顯地影響白切雞中微生物總數(shù)的變化。由圖1可知，在貯藏1～3 d中，白切雞中微生物的總數(shù)表現(xiàn)出下降的趨勢。隨著貯藏時(shí)間的延長，白切雞中的微生物總數(shù)開始增加，在貯藏時(shí)間達(dá)到5～6 d時(shí)，白切雞中的微生物總數(shù)達(dá)到80 000 CFU/g，已經(jīng)不再適合食用。

白切雞中微生物總數(shù)之所以出現(xiàn)這樣的變化趨勢與白切雞中微生物群落的更替密切相關(guān)。在貯藏的前期，白切雞中原有一些中溫微生物因?yàn)椴荒苓m應(yīng)4 ℃的環(huán)境條件相繼死亡，致使此時(shí)其中的微生物總數(shù)表現(xiàn)出下降趨勢。隨后，白切雞中的一些嗜冷和兼性嗜冷微生物開始大量繁殖，微生物總數(shù)升高。由于在4 ℃的環(huán)境中嗜冷和兼性微生物的生長速率較低，所在微生物總數(shù)下降后的一段時(shí)間里，微生物總數(shù)的變化較小。雖然未加靜電場處理的對照組中微生物總數(shù)也表現(xiàn)與處理組相近的趨勢，但是在貯藏前期，靜電場處理組的微生物總數(shù)下降更快，在貯藏后期微生物總數(shù)上升也較慢，而且上升與下降之間的過渡期也比對照組長1 d左右。這些結(jié)果表明，靜電場的處理可能會加速微生物死亡、減緩微生物的生長速率，但是，靜電場并不會引起微生物的死亡。這與當(dāng)前諸多文獻(xiàn)中所使用的電場裝備明顯不同[9-11]。

2.2 電場對白切雞中微生物多樣的影響

白切雞處理組與對照組中的微生物多樣性隨著貯藏時(shí)間的延長發(fā)生了較大變化。在貯藏初期檢測到較后期更多的條帶，這表明白切雞在烹制結(jié)束之后會帶有種類眾多的微生物[2，12]。這些種類眾多的微生物主要來源于原料雞，因?yàn)榘浊须u烹制時(shí)間較短，未能完全殺滅其中的微生物[12]。在貯藏進(jìn)入第3、4 天時(shí)，微生物的種類急劇下降。這主要是因?yàn)樵? ℃的環(huán)境中不能適應(yīng)的微生物大量死亡，而適應(yīng)該環(huán)境的微生物還未大量增殖。隨著貯藏時(shí)間的繼續(xù)延長，適應(yīng)貯藏條件微生物大量繁殖，從而在DGGE圖譜中表現(xiàn)出更多的條帶。白切雞中微生物總數(shù)的這種變化均勢與其他肉類產(chǎn)品類似[13-14]。

2.3 DGGE中主要條帶的鑒定

條帶 相似菌株（拉丁名） 登錄號 相似度/%

1 Pseudomonas fragi AB685617 99

2 Methyloversatilis thermotolerans NR_116751 99

3 Pantoea agglomerans NR_116751 99

4 Propionibacterium acnes NR_074675 99

5 Microbacterium lemovicicum NR_118267 99

6 Pseudomonas sp. JSPB5 JQ308618 99

7 P. chlororaphis HM241942 99

8 P. psychrophilas strain HA-4 JQ968688 99

9 Photobacterium phosphoreum NR_115205 99

10 Pseudomonas koreensis KJ767342 99

11 Burkholderia seminalis NR_042635 99

12 Pseudomonas brassicacearum NR_074834 99

假單胞菌是白切雞中主要的腐敗微生物，占鑒定條帶的50%，它在白切雞的整個貯藏過程中一直是優(yōu)勢菌株，這與王志江等[2]的研究結(jié)果一致。此外，本研究在白切雞中還檢測到了泛菌屬、微桿菌屬、發(fā)光桿菌屬、伯克霍爾德菌屬及克雷伯氏屬等的微生物。這些結(jié)果再次表明白切雞中的微生物具有較高的多樣性。

雖然王志江[2]、蔣宇飛[12]等也對白切雞貯藏過程的微生物總數(shù)的變化做了研究，但是這些研究的對象多是經(jīng)過超高壓、微波等減菌手段處理過的真空包裝產(chǎn)品，沒有真實(shí)地反應(yīng)出白切雞中原有微生物的組成。本研究雖然也使用靜電場處理的手段，但是與對照組相比靜電場的作用并沒有從DGGE的條帶上明顯地表現(xiàn)出來，這也表明靜電場是一種比較溫和的處理方式，它不能徹底地殺死白切雞中的微生物。

2.4 白切雞中腐敗微生物的分離鑒定

通過DGGE分析，確定了白切雞中主要的腐敗微生物為假單胞菌，但是此方法并不能獲得純的肉源性假單胞菌。因此，對白切雞中的假單胞菌進(jìn)行了分離和鑒定。通過多次純化和鑒定，共獲得了5 種假單胞菌，分別為P. koreensis、P. fragi、P. chlororaphis、Pseudomonas sp. JSPB5和P. psychrophilas strain HA-4。其中，P. koreensis、P. chlororaphis和P. fragi是生肉及其制品中最主要的腐敗微生物[8， 16-19]。分離、鑒定的結(jié)果與DGGE分析結(jié)果基本一致，這也表明假單胞菌是引起白切雞腐敗的主要微生物。本研究的結(jié)果也再次證實(shí)了“雞中第一鮮”的白切雞確實(shí)存在殺菌不徹底的問題[12]。

2.5 靜電場對純種微生物的影響

為以獲得的5 種假單胞菌為研究對象，研究靜電場對它們在固體培養(yǎng)基上生長時(shí)的特性，結(jié)果如圖3所示。

A. P. koreensis；B. Pseudomonas sp. JSPB5；C. P. chlororaphis；D. P. psychrophilas strain HA-4；E. P. Fragi。

不同假單胞菌株對靜電場的響應(yīng)方式差異較大。與對照組相比，靜電場中培養(yǎng)的P. koreensis和Pseudomonas sp. JSPB5幾乎沒有表現(xiàn)出明顯的生長抑制，而P. chlororaphis、P. psychrophilas和P. fragi則表現(xiàn)出了明顯的生長抑制。這表明靜電場對微生物生長的影響是有種屬差異性的。

靜電場對微生物菌株的影響是通過改變微生物及其內(nèi)部生命大分子的電荷分布來達(dá)到的[20]。在真核生物中，微管蛋白通常很容易受電場作用而導(dǎo)致真核細(xì)胞的分裂出現(xiàn)異常[21]。作為原始生物的假單胞菌雖然不存在真核生物那樣的微管結(jié)構(gòu)，但是存在與微管功能類似的FtsZ[22]，從而使其成為電場作用的一個目標(biāo)[11]。另外，電場也可能會干擾到酶與底物分子的結(jié)合及酶的正常功能，從而影響到微生物細(xì)胞的正常代謝活動[19]。

3 結(jié) 論

白切雞是一種原始帶菌量比較高的產(chǎn)品，通過靜電場處理可以延長白切雞產(chǎn)品的貨架期。白切雞中的微生物以來源于產(chǎn)品原料的假單胞菌屬的微生物為主。靜電場對純種微生物生長的抑制存在種屬差異性。

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