付航等

【摘要】目的：觀察敦煌平胃丸對(duì)胃癌前病變（PLGC）模型大鼠胃黏膜組織Notch信號(hào)通路中Notch2和Jagged1表達(dá)的影響。方法：采用復(fù)合法建立PLGC大鼠模型，將32只大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。敦煌平胃丸組用敦煌平胃丸浸膏按每日生藥96 g / kg摻入飼料中喂養(yǎng)給藥，共計(jì)12周。觀察大鼠胃黏膜病理組織學(xué)變化；采用Western Blot檢測(cè)Notch2和Jagged1蛋白表達(dá)；采用RT-PCR檢測(cè)Notch2和Jagged1mRNA的表達(dá)。結(jié)果：PLGC大鼠胃黏膜組織Notch2 與Jagged1mRNA及蛋白表達(dá)較正常大鼠胃黏膜組織均明顯上調(diào)（P<005）。敦煌平胃丸能明顯改善PLGC大鼠胃黏膜腺體萎縮、腸化增生，下調(diào)PLGC大鼠胃黏膜組織中Notch2 與Jagged1表達(dá)水平（P<005）。結(jié)論：Notch2、Jagged1激活了Notch信號(hào)通路，在PLGC發(fā)生發(fā)展中有重要意義。敦煌平胃丸治療PLGC可能與下調(diào)Notch信號(hào)通路中Notch2 與Jagged1表達(dá)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】敦煌平胃丸；胃癌前病變；Notch2、Jagged1

【中圖分類(lèi)號(hào)】R2855【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2015）01-0018-04

Abstract：Objective To observe the Dunhuang pingwei pill on the expression of Notch2 and Jagged1 in the Notch signal pathway in rats with precancerous lesions of gastric cancer.Methods To establish the rat model of PLGC by using composite method， 32 rats were randomly divided into 4 groups， 8 rats in each group， Dunhuang pingwei pill group were fed with Dunhuang pingwei concrete according to daily crude drug 96 g/kg soak in feedstuff ， a total of 12 weeks.Observe changes in gastric mucosa pathological histology in rats.Using Western Blot to detect protein expression of Notch2 and Jagged1， the transcriptions of Notch2 and Jagged1mRNA were demonstrated by RT-PCR technique.Result Compared to the normal rats， Notch2 and Jagged1mRNA、protein expression were significantly up-regulated in gastric mucosa histology in rats with PLGC .（P< 005）.Dunhuang pingwei pill can obviously improve the gastric mucosa gland atrophy， intestinal metaphases and hyperplasia ， down-regulate the expression level of Jagged1andNotch2 in gastric mucosa tissue in rats with PLGC .（P< 005）.Conclusion Notch2， Jagged1 activates Notch signaling pathways in PLGC， it is important to the development of PLGC.Dunhuang pingwei pill in the treatment of PLGC maybe associated with down-regulating expression of Notch2 and Jagged1 in Notch signal pathway.

Keywords：Dunhuang pingwei pill， PLGC，Notch2，Jagged1

胃癌前病變（ gastric precancerous lesions， PLGC）是胃黏膜腸上皮化生（intestinal metaplasia，IM）和異型增生（ Dysplasia，Dys）的一種病理狀態(tài)。研究顯示Notch信號(hào)通路參與了胃黏膜的癌變過(guò)程[1]。敦煌平胃丸源于敦煌遺書(shū)，該方臨床治療慢性萎縮性胃炎及胃癌前病變療效確切[2-3]。為了進(jìn)一步揭示敦煌平胃丸的藥效及作用機(jī)理，本研究以PLGC大鼠為模型，研究了敦煌平胃丸對(duì)胃黏膜Notch信號(hào)通路中Notch2和Jagged1表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料

11實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF級(jí)健康Wistar大鼠，體重（160±10）g，雌雄各半，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，均由甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（甘）2011-0001-0001163。

12實(shí)驗(yàn)藥物敦煌平胃丸（方藥組成：人參、土鱉蟲(chóng)、當(dāng)歸、苦參、大黃、桔梗、干姜、防風(fēng)、篙本、玄參），藥材飲片購(gòu)自蘭州復(fù)興厚藥材有限責(zé)任公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定符合藥典規(guī)定。將處方中藥材飲片按一定比例，置多能提取器中，加水煎煮兩次，第一次加8倍量水，煎煮15h，第二次加6倍量水，煎煮1h，合并兩次煎液，離心濾過(guò)，濾液減壓濃縮至含生藥2g/ml的浸膏，保存?zhèn)溆谩?/p>

13試劑及儀器甲基硝基亞硝基胍（MNNG），購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)M0527；Notch2及Jagged1抗體購(gòu)自蘭州維科生物工程有限公司（批號(hào)RMA0546）；胎牛血清購(gòu)自蘭州維科生物工程有限公司；EastepTM通用型總 RNA 提取試劑盒：型號(hào)LS1OO，普洛麥格上海生物產(chǎn)品有限公司；RNAse-Exitus PLUS（德國(guó)Applichem公司），批號(hào)OD008558；超聲波破碎儀（德國(guó)merck公司）；超微量分光光度計(jì)（K5500北京凱奧科技公司）；凝膠成像分析儀（170-8170，美國(guó)BIO RAD公司）；PCR熱循環(huán)儀（C1000，美國(guó)BIO RAD公司）。

2方法

21大鼠模型建立及分組給藥

211PLGC大鼠模型建立參考文獻(xiàn)方法[4]，采用復(fù)合法建立PLGC模型：用蒸餾水175ml和40℃50%的酒精75ml充分?jǐn)噭蚺涑?0g/l的母液250ml（每周配1次），于4℃冰箱保存。使用前將MNNG加入母液，稀釋成濃度為100μg/ml的溶液，避光保存。各造模組大鼠自由飲用MNNG與酒精復(fù)合溶液；各造模組大鼠雷尼替丁與 60℃150g/熱鹽水按225g/L混合后灌胃。各造模組大鼠均配合饑飽失常（2d飽食，1d禁食）。

212分組及給藥32只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4組，每組8只：空白對(duì)照組，常規(guī)喂養(yǎng)；PLGC模型組，按照前述方法造模，常規(guī)喂養(yǎng)，共計(jì)12周；自然恢復(fù)組，按前述方法造模，常規(guī)喂養(yǎng)，共計(jì)12周，第13周造模結(jié)束后，繼續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)12周；敦煌平胃丸組，按照前述方法造模，常規(guī)喂養(yǎng)，共計(jì)12周，第13周開(kāi)始，按每日生藥96g/kg劑量（相當(dāng)于60kg成人劑量的20倍計(jì)算），將敦煌平胃丸浸膏，摻入飼料中喂養(yǎng)12周。

22各組大鼠胃黏膜病理組織觀察及積分將大鼠禁食24h后（自由飲水），腹部注射20%烏拉坦（約10ml/kg），剖腹取胃，沿胃大彎切開(kāi)，PBS 溶液漂洗2遍后，肉眼觀察大鼠胃壁彈性、黏膜色澤。剪取胃竇部胃組織，將其置于10%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，染色，光鏡下觀察胃黏膜厚度，腺體排列及腸化增生情況。參考文獻(xiàn)方法[5]，分別從胃黏膜充血、炎性程度、胃黏膜糜爛程度、胃黏膜萎縮、腸化增生等方面進(jìn)行評(píng)分。

23Western Blot檢測(cè)各組大鼠胃黏膜組織Notch2和Jagged1蛋白的表達(dá)取胃竇組織，每100mg組織加1ml預(yù)冷的蛋白提取試劑，提取組織蛋白質(zhì)。超聲破碎儀粉碎組織，加入RIPA緩沖液勻漿，超微量分光光度計(jì)測(cè)蛋白質(zhì)濃度；取100μl上清液，取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液，并加等體積的電泳加樣緩沖液，沸水浴中3min，上樣、電泳（濃縮膠20mA，分離膠35mA），電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（100mA 40min），膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色，Western blot ECL試劑盒顯色，采用博德公司的凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，并用Quantity One42軟件分析目標(biāo)條帶蛋白與β-actins蛋白的積分光密度比值，計(jì)算相對(duì)量。

24RT-PCR檢測(cè)各組大鼠胃黏膜組織Notch2和Jagged1 mRNA的表達(dá)取胃竇組織，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 的濃度和純度。cDNA的合成采用5μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，42℃反應(yīng)60min。反應(yīng)條件：變性，95℃，2min；退火，42～65℃，1min，25～35循環(huán)；延伸，72℃，5min。使用Promega公司的GO Tap Green Master Mix 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增物進(jìn)行20%瓊脂糖凝膠電泳。PCR引物由采用 Primer premier 5 及 Oligo 6 等生物軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，目的基因片段長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為100bp，內(nèi)參片段長(zhǎng)度設(shè)計(jì)為150bp。Notch2和Jagged1基因引物見(jiàn)表1。采用博德公司的凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，并用Quantity One42軟件分析目標(biāo)條帶mRNA與β-actins的mRNA的積分光密度比值，計(jì)算相對(duì)量。

4討論

Notch信號(hào)通路廣泛存在于脊椎動(dòng)物和非脊椎動(dòng)物，進(jìn)化上高度保守[6]。Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、CSL（CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱(chēng)）DNA結(jié)合蛋白等組成。已知哺乳動(dòng)物有Notch1、 Notch 2、 Notch 3、Notch4等4種Notch受體和Deltal、Delta3、Delta4、Jaggedl、Jagged2等5種配體。當(dāng)Notch受體與鄰近的細(xì)胞表面的配體相結(jié)合時(shí)，其胞內(nèi)區(qū)被切割，從細(xì)胞膜上脫離，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核并與下游分子相互作用以傳遞Notch發(fā)揮生物學(xué)功能[7]。研究表明Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中Notch1-3受體及Jaggedl、Jagged2、Delta1等配體在正常胃黏膜中都有表達(dá)，在胃癌組織中則呈現(xiàn)高表達(dá)[8]，提示Notch信號(hào)通路可能參與了胃黏膜的癌變過(guò)程。但Notch信號(hào)通路是否參與了PLGC發(fā)生發(fā)展，尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。

PLGC屬中醫(yī)“胃痞”范疇。中醫(yī)認(rèn)為PLGC的發(fā)生是一個(gè)邪氣漸深，正氣漸傷的過(guò)程，這與“慢性胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃癌”的疾病模式有相似之處。胃黏膜炎癥經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期病理演變，初起在經(jīng)在氣，以脾胃失和，氣機(jī)阻滯為主，久則在絡(luò)在血，寒濕、郁熱、瘀血等邪毒蜂起，使胃絡(luò)不通；久則耗傷正氣，脾胃虛弱，氣陰虧虛，胃絡(luò)失于濡養(yǎng)，導(dǎo)致腺體萎縮、黏膜腸化增生，數(shù)證交錯(cuò)，相互摯制，從而使病勢(shì)膠著，遷延不愈。故我們認(rèn)為毒邪內(nèi)蘊(yùn)、胃絡(luò)不通、胃絡(luò)損傷是炎癥誘導(dǎo)PLGC發(fā)生的關(guān)鍵病機(jī)；脾虛陽(yáng)陷、氣陰虧虛、胃絡(luò)失養(yǎng)是PLGC的病理轉(zhuǎn)歸；虛實(shí)夾雜、寒熱錯(cuò)雜是其主要證候特征。

基于上述認(rèn)識(shí)，我們提出“消散毒邪，以通胃絡(luò)，升陽(yáng)健脾、益氣養(yǎng)陰以養(yǎng)胃絡(luò)”治療PLGC的思路。敦煌平胃丸組方用藥符合這一治療思路，是我們臨床治療PLGC的常用方劑，療效顯著。該方源于敦煌遺書(shū)P·3287卷子[9]，由人參、土鱉蟲(chóng)、當(dāng)歸、苦參、大黃、玄參、干姜、防風(fēng)、篙本、桔梗等組成。方中以土鱉蟲(chóng)、大黃、當(dāng)歸活血祛瘀，通經(jīng)活絡(luò)，以解瘀毒阻滯胃絡(luò)；苦參、干姜辛開(kāi)苦降，恢復(fù)中焦升降之職，以解寒濕、邪熱內(nèi)蘊(yùn)毒邪，佐以甘寒濡潤(rùn)之玄參，與當(dāng)歸合用滋陰養(yǎng)血，防止久病入絡(luò)，耗傷胃絡(luò)陰血，又可制約方中辛苦溫燥藥物傷及陰血；防風(fēng)、篙本、桔梗均為辛散升浮之品，與人參配伍共奏升陽(yáng)健脾。全方虛實(shí)兼顧，寒熱平調(diào)，潤(rùn)燥結(jié)合；既消散毒邪，暢通胃絡(luò)，又升陽(yáng)健脾、益氣養(yǎng)陰，榮養(yǎng)胃絡(luò)。

本研究結(jié)果表明PLGC模型大鼠胃黏膜組織Notch信號(hào)通路中受體Notch2 與配體Jagged1mRNA及蛋白表達(dá)較正常大鼠胃黏膜組織均明顯上調(diào)。經(jīng)自然恢復(fù)后這種高表達(dá)水平并未明顯改變，敦煌平胃丸則能明顯下調(diào)PLGC大鼠胃黏膜組織中Notch2 、Jagged1 mRNA及蛋白表達(dá)水平。我們推測(cè)Notch2 作為的受體、Jagged1作為配體激活了Notch信號(hào)通路，促進(jìn)了胃黏膜腺體萎縮、腸化增生。敦煌平胃丸治療PLGC可能與下調(diào)Notch信號(hào)通路中Notch2 與Jagged1表達(dá)，促進(jìn)胃黏膜組織修復(fù)與重構(gòu)有關(guān)。至于PLGC過(guò)程中是否還有其他Notch信號(hào)通路受體及配體或相關(guān)下游基因參與，敦煌平胃丸對(duì)其是否具有干預(yù)調(diào)節(jié)作用，有待于進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：20141007）