李文成，劉加濤，高 爽，于瀚卿，吳 圣，范璐璐，孫國平

自噬抑制劑在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下對肝癌HepG2細胞和正常肝細胞L-02作用的差異

李文成，劉加濤，高 爽，于瀚卿，吳 圣，范璐璐，孫國平

目的研究自噬在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）狀態(tài)下對肝癌HepG2細胞和正常肝細胞L-02作用的差異。方法體外常規(guī)培養(yǎng)的人肝癌HepG2細胞和正常肝細胞L-02，分別給予衣霉素（TM）單藥和TM聯(lián)合自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（TM ＋3-MA）或氯喹（TM＋CQ）作用12、24、48 h后，采用噻唑藍（MTT）法檢測細胞活力變化，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，Western blot法檢測自噬蛋白LC3的變化。結(jié)果TM可引起HepG2細胞和L-02細胞死亡并呈時間依賴關(guān)系，3-MA或CQ均可增加TM對HepG2細胞的生長抑制作用，24 h細胞存活率分別為TM＋3-MA組（60%）、TM＋CQ組（72%）、TM組（86%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；但對于L-02細胞，其存活率分別為83%、84%、83%，活力沒有明顯差異；流式細胞術(shù)顯示TM＋3-MA、TM＋CQ和TM組對HepG2細胞的凋亡率分別為15%、11%、7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01），但對L-02細胞，凋亡率分別為16%、17%、16%，未見明顯差異；Western blot法結(jié)果顯示TM作用引起兩種細胞自噬增加，自噬抑制劑3-MA與CQ可引起兩種細胞自噬作用減弱。結(jié)論自噬抑制劑（3-MA或CQ）均可顯著增加TM對肝癌HepG2細胞的生長抑制作用，但對正常肝細胞L-02的生長抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義。自噬在ERS狀態(tài)下可對肝癌細胞的生存提供保護，但對正常肝細胞無保護作用。

自噬抑制劑；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；肝癌；肝正常細胞

原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）在我國的發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌，死亡率在所有腫瘤中位居前三位［1］。肝癌細胞對化學(xué)治療藥物相對不敏感，有效率≤20%［2］。如何能提高HCC的化療敏感性已成為當今研究的熱點。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是細胞對一系列可以干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的因素所做出的反應(yīng)。自噬是細胞對惡劣環(huán)境及壓力的一種反應(yīng)，但其對細胞生存的意義并不清楚［3］。該研究旨在觀察自噬在ERS狀態(tài)下對肝癌HepG2細胞及正常肝細胞L-02生存影響的差異，探尋腫瘤特異性治療的新方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑噻唑藍（MTT）、衣霉素（tunicamycin，TM）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、氯喹（chloroquine，CQ）、兔抗人微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3）多克隆抗體均購自美國Sigma公司；抗β-actin多克隆抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC細胞雙染凋亡試劑購自上海貝博公司。

1.2 主要儀器設(shè)備包括Acpo-6100 CO2培養(yǎng)箱（美國杜邦公司）；YJ-1450型醫(yī)學(xué)凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；倒置式顯微鏡（日本Olympus公司）；Elx-800型酶標儀（美國Bio-Tek儀器公司）；EPICS XL／XL-MCL流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；ImageQuantTMLAS-4000型發(fā)光成像系統(tǒng)（日本通用電氣醫(yī)療集團生命科學(xué)部）。

1.3 細胞系人HepG2肝癌細胞株購自中科院上海生命科學(xué)院細胞庫；人L-02細胞購自武漢細胞庫。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)液及細胞懸液的制備 人肝癌HepG2細胞和人正常肝細胞L-02分別培養(yǎng)于含10%新生胎牛血清的DMEM和1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4.2 MTT法檢測增殖抑制率 取對數(shù)生長期的HepG2及L-02細胞，以5.0×103個／孔的細胞密度接種于96孔板中，設(shè)實驗組（TM＋3-MA組、TM＋CQ、TM組）、細胞對照組和空白組。待細胞貼壁后，分別加入3-MA（5 mmol／L）和CQ（5 μg／ml）預(yù)處理細胞1 h，然后每孔加入3 μmol／L的TM，以只加培養(yǎng)液的細胞設(shè)為細胞對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔。共同培養(yǎng)12、24、48 h后，每孔加入MTT溶液繼續(xù)孵育4 h，吸出各孔培養(yǎng)液，再加入DMSO 150 μl，用酶標儀在490 nm波長下測定各孔吸光度（optical density，OD）值，并計算細胞存活率。細胞存活率（%）＝（OD實驗組值－OD空白組值）／（OD對照組值－OD空白組值）×100%。

1.4.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將未處理及藥物處理組的HepG2細胞和L-02細胞終止培養(yǎng)，消化后收集離心、PBS溶液洗滌2次，重混懸于400 μl結(jié)合緩沖液中。按照Annexin V-FITC／PI凋亡檢測試劑盒說明書分別加入Annexin V和PI染液，立刻進行流式細胞術(shù)檢測，F(xiàn)lowJo軟件進行數(shù)據(jù)分析。將全部細胞分為4群，Q4：Annexin V-PI-認為是存活細胞；Q3：Annexin V＋PI-認為是早期凋亡細胞；Q2：Annexin V＋PI＋認為是凋亡后繼發(fā)壞死細胞；Q1：Annexin V-PI＋認為是壞死細胞。計算細胞凋亡率（%）＝（Annexin V＋PI＋細胞數(shù)＋Annexin V ＋PI-細胞數(shù)）／10 000×100%。

1.4.4 Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達 將未處理及藥物處理組的HepG2細胞和L-02細胞終止培養(yǎng)，冷PBS洗3遍，冰上裂解后離心，收集上清液，采用BCA法蛋白定量后，加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，取10 μl蛋白進行實驗：用12.5%SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h，洗膜后，加入一抗置于濕盒中，4℃孵育過夜。次日，洗膜后，加入二抗室溫孵育2 h，最后加入電化學(xué)發(fā)光試劑，采用ImageQuantTMLAS-4000型發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白熒光信號并顯像。ImageJ分別測量LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ條帶的積分光密度值，以LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ值來反映LC3的轉(zhuǎn)變。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析和LSD法進行兩兩比較。圖表均在GraphPad Prism 5軟件中完成。

2 結(jié)果

2.1 3-MA或CQ對兩種細胞的增殖抑制率MTT檢測結(jié)果顯示，3-MA或CQ聯(lián)合TM共同培養(yǎng)HepG2細胞12、24、48 h后，HepG2細胞活力明顯下降（F＝41.782、30.215、131.806，P＜0.01），見圖1A。3-MA或CQ聯(lián)合TM共同培養(yǎng)L-02細胞12、24、48 h后，48 h TM＋CQ組與TM組比較，L-02細胞活力明顯下降（F48 h＝24.563，P＜0.05），其他組細胞活力差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F12 h＝0.898，F(xiàn)24 h＝0.437）。見圖1B。自噬對肝癌HepG2細胞可能發(fā)揮著保護作用；但對正常肝細胞L-02無保護作用。

2.2 3-MA或CQ對兩種細胞凋亡的影響流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，3-MA或CQ聯(lián)合TM作用HepG2細胞24 h，HepG2細胞凋亡率均顯著高于TM組（F＝97.757，P＜0.01）。TM和TM聯(lián)合3-MA或CQ分別作用于L-02細胞24 h，實驗組凋亡率均高于細胞對照組（F＝142.506，P＜0.01），但各實驗組間凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F＝0.674，P＞0.05）。見圖2。

2.3 自噬相關(guān)蛋白LC3的表達水平Western blot法檢測顯示，HepG2細胞經(jīng)TM作用24 h后，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ灰度值比值較細胞對照組明顯升高，加入自噬抑制劑3-MA或CQ后，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ較TM組下降（F＝168.306，P＜0.01）。L-02細胞亦可見相似的改變（F＝225.420，P＜0.01），見圖3。

3 討論

ERS即未折疊／錯誤折疊蛋白的積聚。輕度ERS時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以通過激活未折疊蛋白反應(yīng)啟動自噬［4］，清除那些超出蛋白酶體清除能力的錯誤折疊蛋白，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，促使細胞存活［5］。而過度或持久ERS時，一方面可通過啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡途徑［6］促使細胞凋亡；另一方面可通過過度激活內(nèi)噬致使自噬性細胞死亡（autophagic cell death，ACD）［7］。ERS誘導(dǎo)劑TM抑制蛋白質(zhì)的N－端的糖基化，從而使不能折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)發(fā)生大量蓄積，從而引起ERS的發(fā)生［8］。TM作用后兩種細胞LC3-I向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化均明顯增加，說明ERS狀態(tài)下自噬是激活的。

ERS可以誘導(dǎo)自噬，為觀察ERS狀態(tài)下使用不同作用機制的自噬抑制劑抑制自噬對于細胞生存的影響，本研究分別選擇作用于自噬通路上游激酶Ⅲ類磷脂酰肌醇-3激酶，促進早期自噬體成核階段的3-MA和抑制自噬晚期階段溶酶體降解的CQ，觀察ERS狀態(tài)下抑制自噬對于細胞增殖、凋亡的影響。與TM組比較，聯(lián)合自噬抑制劑組的HepG2細胞活力明顯下降，凋亡明顯增加。但相同條件下，在L-02細胞中加入3-MA，3個時間點均未見L-02細胞活力有明顯差異；而TM＋CQ組僅在作用48 h后，顯示細胞活力下降，提示在ERS狀態(tài)下，CQ長時間作用，可導(dǎo)致自噬體不斷積聚，但其降解途徑受阻，故細胞結(jié)構(gòu)大量破壞，或可導(dǎo)致ACD，從而增加細胞死亡率。推測自噬在ERS狀態(tài)下可對肝癌細胞提供生存保護，對正常肝細胞L-02的增殖和凋亡無明顯影響。研究［3］顯示，ERS誘導(dǎo)的自噬作用是清除多泛素化蛋白的聚集和減少在HCT116結(jié)腸癌細胞和DU145前列腺癌細胞空泡化，從而減輕ERS和防止細胞死亡。與此相反，相同的化學(xué)品誘導(dǎo)的自噬不會為正常的人類結(jié)腸細胞提供保護，并在未轉(zhuǎn)化的小鼠胚胎成纖維細胞反而促進細胞死亡。體外研究［9］表明，抑制自噬后，蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)凋亡的效果會在惡性轉(zhuǎn)化的細胞中增加，而在正常細胞中無明顯變化。

LC3蛋白是酵母自噬相關(guān)蛋白的同源蛋白，理論上自噬時應(yīng)表現(xiàn)為LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的增加，通過LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ或者LC3-Ⅱ／（LC3-Ⅰ＋LC3-Ⅱ）即可反映自噬水平［10］。本實驗顯示，兩種細胞在分別加入3-MA后，與TM組比較，均觀察到相應(yīng)的LC3-Ⅰ的增加及LC3-Ⅱ的減少，符合3-MA阻斷LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變的作用機制，從而抑制自噬的發(fā)生。加入CQ后，可見LC3-Ⅱ蛋白明顯積聚，通過這種基于自噬性降解的自噬潮分析，可見自噬活性被抑制，同時，也可反映整個自噬過程是通暢的。在L-02細胞中，TM組看不到LC3灰度值上調(diào)的現(xiàn)象，但TM ＋CQ組LC3-Ⅱ蛋白的高表達，可推測因細胞自噬活性很強，自噬體降解速度很快，自噬的激活不斷消耗胞質(zhì)內(nèi)的LC3，所以僅檢測出很弱的表達［11］。

綜上所述，本研究證實自噬在ERS狀態(tài)下可對肝癌細胞提供生存保護，而同樣的條件下，卻未能為正常的肝細胞提供保護作用。這種正常細胞與腫瘤細胞對自噬反應(yīng)差異的原因仍需進一步研究。如果這種現(xiàn)象得到證實，那么ERS誘導(dǎo)劑和自噬抑制劑的聯(lián)合使用對于癌癥的治療將會起著重要的作用，或可為腫瘤的特異性治療提供新的方向。本研究僅限于體外培養(yǎng)的細胞株的觀察，進一步的分子機制及體內(nèi)的效應(yīng)有待進一步研究。

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The different function of autophagy inhibitors between HepG2 liver cancer cells and normal liver cells L-02 in the endoplasmic reticulum stress state

Li Wencheng，Liu Jiatao，Gao Shuang，et al
（Dept of Medical Oncology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the difference in function of autophagy inhibitors between HepG2 and L-02 cells in the state of endoplasmic reticulum stress.MethodsThe HepG2 cells and L-02 cells were routinely cultured in vitro and treated either with tunicamycin（TM）or combination with the autophagy inhibitors 3-methylade-nine（3-MA）or chloroquine（CQ）.The cell viability was detected by MTT assay.Cell apoptosis was detected by flow cytometry.The change of autophagy-related protein LC3 was analysed by Western blot assay.ResultsMTT assay demonstrated that TM could time-dependently induce the death of HepG2 cells and L-02 cells，and the cell viability of HepG2 cells was significantly restrained when it was administrated in combination with 3-MA or CQ，the cell survival rates of 24 h were：3-MA＋TM（60%），CQ＋TM（72%），TM（86%）respectively，and the difference was statistically significant（P＜0.01）.However，it had no significant effect with L-02 cells because of its cell survival rates of 24 h were：83%，84%and 83%.Flow cytometry apoptosis experiment found that：TM＋3-MA，CQ＋TM and TM group on HepG2 cell apoptosis rates were 15%，11%and 7%respectively，and the difference was statistically significant（P＜0.01）.But for L-02 cell group，the apoptosis rates were 16%，17%，16% which had no obvious difference.According to the results of Western blot，TM could cause increased autophagy，and autophagy inhibitor CQ could lead to increased autophagy tide.ConclusionThe cell viability of HepG2 cells，not the L-02 cells，can be significantly restrained by TM combined with different autolysosome inhibitor 3-MA or CQ.So the autophagy can protect the hepatocarcinoma cell line HepG2 under the state of endoplasmic reticulum stress，and it can’t provide the same protection to L-02 cell line.

autophagy inhibitors；endoplasmic reticulum stress；liver neoplasms；liver cell

R 735.7

A

1000－1492（2015）07－0884－05

2015－03－17接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81272739）；安徽省科技攻關(guān)項目（編號：12010402122）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，合肥 230022

李文成，女，碩士研究生；孫國平，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：sunguoping＠ahmu.edu.cn