楊小四，劉曉利，宋先兵，張俊強，趙 歡，陳曉宇

β-catenin、DKK-1蛋白在出生前后雙酚A暴露的子鼠雄性生殖細胞中的表達

楊小四1，2，劉曉利1，宋先兵1，張俊強1，趙 歡1，陳曉宇1

目的探討Wnt／β-catenin信號通路主要蛋白（βcatenin、DKK-1）在出生前后雙酚A（BPA）暴露的成年子鼠雄性生殖細胞中的表達及意義。方法自受孕第0天（PGD0），ICR孕鼠飲水BPA染毒，隨機將孕鼠分為溶劑對照組、BPA低劑量（10 nmol／L）組、BPA中劑量（50 nmol／L）組、BPA高劑量（300 nmol／L）組，每組6只。雄性仔鼠出生后繼續(xù)飲水染毒，劑量同上，6周（PGD42）處死，取睪丸組織，計算睪丸系數(shù)；免疫組化和Western blot法檢測β-catenin、DKK-1蛋白的表達。結(jié)果BPA暴露組較溶劑對照組仔鼠睪丸臟器系數(shù)降低，β-catenin、DKK-1蛋白表達明顯增加；免疫組化顯示，β-catenin、DKK-1蛋白多位于睪丸間質(zhì)細胞和精原細胞中。結(jié)論β-catenin、DKK-1可能參與了出生前后BPA暴露對子鼠雄性生殖細胞發(fā)育的影響。

雙酚A；β-catenin蛋白；DKK-1蛋白；睪丸生殖細胞

雙酚A（bisphenol A，BPA）是現(xiàn)代生活中人們不可避免接觸到的一類酚類環(huán)境雌激素，廣泛存在于塑料制品中，通過食品包裝材料、醫(yī)療器械和染料等塑料工業(yè)，經(jīng)高溫水解或酸、堿作用釋放進入機體，干擾機體自身激素的合成和分泌等，對機體具有潛在、長期、破壞性的影響［1］。研究［2－3］證實孕期暴露BPA會影響子代雄鼠的生殖系統(tǒng)，但BPA影響機體的作用機制多樣。Wnt／β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號通路是一個關(guān)鍵信號通路，調(diào)節(jié)機體生長和發(fā)育［4］。目前Wnt／β-catenin信號通路在生殖細胞方面的研究較少。該研究通過小鼠出生前后暴露BPA，研究BPA對雄性小鼠睪丸組織的影響機制是否與Wnt／β-catenin信號通路有關(guān)，探討出生前后接觸BPA的子鼠雄性生殖細胞形成過程中與Wnt／βcatenin信號通路的關(guān)系及其下游調(diào)控主要蛋白βcatenin、DKK-1表達，旨在為闡明Wnt／β-catenin信號通路在BPA暴露的致畸作用提供一定的分子機制，為制定相應(yīng)的防治措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器BPA（美國Sigma公司）；兔抗鼠多克隆抗體β-catenin、DKK-1、GAPDH（美國Santa Cruz公司）；羊抗兔免疫組化二抗試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（海門碧云天公司）；PVDF膜（美國Bio-Rad公司）；Super Singal化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Pierce公司）；實驗所需其他試劑均為分析純；TSJ-1A型自動組織脫水機（天津天利航空機電有限公司）；RM2135型石蠟切片機（德國Leica公司）；BM-Ⅱ病理組織包埋機（安徽電力科學(xué)研究所）；80i生物顯微攝像和分析系統(tǒng)（日本Nikon公司）；BS210S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；SZ-97自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；BPA采用少量DMSO溶解配成1 mg／ml的母液，置于4℃冰箱保存，臨用時以純水稀釋至所需濃度（DMSO終濃度小于0.01%）。

1.2 實驗動物60只ICR雌鼠，30只ICR雄鼠，8 ～10周齡，體重（30.5±2.2）g，購自安徽省實驗動物中心，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)毒理教研室動物房。ICR鼠自由進食，飼養(yǎng)室溫（22±2）℃，光照維持12 h光照／12 h黑暗的晝夜節(jié)律，光照從早上7點開始，ICR鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與給藥 90只成年ICR小鼠于晚上9時以雌鼠∶雄鼠為2∶1進行合籠，于次日上午9時檢查ICR雌鼠是否妊娠，妊娠標(biāo)準(zhǔn)為檢到陰栓。即確定為妊娠第0天（PGD0）。然后隨機分為溶劑對照組、BPA低劑量組（10 nmol／L）、BPA中劑量組（50 nmol／L）、BPA高劑量組（300 nmol／L），每組6只。為保持自然狀態(tài)，BPA采取自由飲水方式攝入，為保證BPA飲入濃度穩(wěn)定，ICR孕鼠每2 d稱重1次；孕鼠自PGD0起開始染毒，哺乳期間繼續(xù)染毒，斷乳后雄性仔鼠繼續(xù)染毒至產(chǎn)后42 d（PGD42），脫頸椎處死，無菌操作下取雄性ICR仔鼠睪丸組織，稱量睪丸濕重，計算睪丸臟器系數(shù)。睪丸臟器系數(shù)＝睪丸濕重／體質(zhì)量。將左側(cè)睪丸組織用于形態(tài)學(xué)檢查，右側(cè)睪丸組織置液氮凍存?zhèn)錅y蛋白等。

1.3.2 免疫組化染色檢測雄性ICR仔鼠睪丸組織β-catenin、DKK-1蛋白表達 將新鮮左側(cè)睪丸組織置于10%多聚甲醛中固定，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，取出蠟塊后置于－20℃冰箱，冷凍適度后，用石蠟切片機切成4 μm厚的切片，90℃燒烤30 min，即可進行常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水，0.01 mol／L枸櫞酸鈉緩沖液微波抗原修復(fù)，3%H2O2于37℃溫箱孵育20 min，50 μl／片山羊血清封閉，37℃恒溫孵育30 min，吸去封閉血清、不需PBS沖洗；滴加50 μl／片兔抗鼠多克隆一抗β-catenin（1∶300）、DKK-1（1∶200），4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加50 μl／片生物素化山羊抗兔IgG工作液，37℃恒溫孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加50 μl／片羊抗兔辣根酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白二抗工作液，37℃恒溫孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；DAB顯色，細胞核采用蘇木精復(fù)染；進行常規(guī)梯度乙醇上行脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。采用Nikon 80i生物顯微攝像與分析系統(tǒng)，觀察并記錄40倍物鏡下每個視野中β-catenin、DKK-1陽性蛋白表達數(shù)目。

1.3.3 Western blot法檢測β-catenin、DKK-1蛋白表達 取右側(cè)睪丸組織，取樣、稱重、勻漿，按照試劑盒說明書配置細胞裂解液裂解勻漿，3 000 r／min離心10 min，提取蛋白，BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫下封閉1 h；加入兔抗鼠單克隆一抗β-catenin（1∶2 000）、DKK-1（1∶1 500）、GAPDH（1∶3 000），4℃冰箱孵育過夜；次日TBST脫洗3次，每次5 min；然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（1∶3 000）37℃孵育1 h，再TBST脫洗3次，每次5 min；ECL檢測液發(fā)光顯影定影、X線片曝光、洗片，Image J軟件進行灰度半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 15.0軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 BPA暴露對雄性子鼠睪丸臟器系數(shù)的影響母鼠自懷孕PGD0開始BPA染毒，實驗各組每只母鼠所產(chǎn)的子鼠的雌雄比例無顯著差異。與溶劑對照組比較，BPA暴露組的小鼠6周的睪丸重量下降，且隨著BPA暴露劑量的增加，子代雄鼠的睪丸臟器系數(shù)下降愈加明顯，睪丸臟器系數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

2.2 免疫組化法檢測睪丸組織β-catenin、DKK-1蛋白表達情況溶劑對照組中β-catenin、DKK-1蛋白表達很弱或幾乎不表達；BPA暴露組中β-catenin、DKK-1蛋白表達明顯增強，有劑量依賴趨勢，且陽性表達細胞多位于近生精小管基膜的精原細胞和睪丸間質(zhì)細胞中。見圖2。通過Nikon 80i生物顯微攝像和分析系統(tǒng)觀察并計數(shù)（×400）每個視野βcatenin、DKK1蛋白表達數(shù)目。隨著BPA暴露劑量的增加，β-catenin、DKK-1陽性細胞數(shù)逐漸增多，βcatenin、DKK-1蛋白陽性細胞計數(shù)與溶劑對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

2.3 Western blot法檢測睪丸組織β-catenin、DKK-1蛋白表達情況溶劑對照組中β-catenin、DKK-1蛋白較弱，隨著BPA暴露劑量的增加，βcatenin、DKK-1蛋白表達呈上升趨勢；BPA暴露組β-catenin／GAPDH、DKK-1／GAPDH與溶劑對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

研究［5］顯示低劑量的BPA即對機體，包括胚胎發(fā)育、生殖、神經(jīng)與免疫系統(tǒng)等產(chǎn)生一定的影響。研究［2，6］表明，BPA能引起受試小鼠精子畸形率大幅增加，精子生成量明顯減少、發(fā)育過程嚴(yán)重障礙，且存在明顯的劑量依賴性。與對照組比較，睪丸系數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），臟器系數(shù)用來反映臟器的腫大或是縮小、增生或是萎縮等變化，即臟器質(zhì)量與體重的比值，在體重變化不是很顯著時，是對毒物導(dǎo)致臟器損傷的一個比較靈敏的指標(biāo)。本研究顯示，出生前后BPA染毒導(dǎo)致了小鼠的睪丸臟器系數(shù)下降，提示BPA對子代雄性小鼠生殖細胞有一定的毒性作用，不同染毒劑量BPA暴露組對子鼠睪丸臟器系數(shù)均有影響且影響不同，隨著BPA染毒劑量的增加，睪丸臟器系數(shù)呈下降趨勢。亦提示了BPA對小鼠的睪丸臟器的毒性有劑量依賴性。

BPA的作用機制多樣，Wnt／β-catenin信號通路是機體生長和發(fā)育調(diào)節(jié)的一個重要的信號通路，其組成主要包括Wnt蛋白、β-catenin、Tcf／Lef核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子家族及其下游靶基因［7］。β-catenin是最早發(fā)現(xiàn)的黏附因子，是一種多功能的蛋白質(zhì)，主要位于細胞膜，其功能主要為介導(dǎo)細胞間黏附和參與基因的表達，廣泛存在于各型細胞中，參與細胞增殖、分化和凋亡［8］。在胚胎發(fā)育過程中，Wnt／β-catenin信號通路的下游靶基因多數(shù)為調(diào)控細胞周期的重要基因，在促進胚胎背腹軸的形成、加強細胞極性建立、引導(dǎo)細胞命運決定等多個環(huán)節(jié)中起重要作用［9］。誘導(dǎo)Wnt／β-catenin信號通路下游通路中的抑制劑骨形態(tài)蛋白（Bmps）和DKK-1蛋白表達，可誘導(dǎo)胚胎細胞凋亡，導(dǎo)致出生缺陷［10］，故DKK-1是Wnt／βcatenin信號通路下游通路中重要蛋白。

BPA通過干擾血睪屏障，導(dǎo)致生精細胞粘附力降低，進而導(dǎo)致生精細胞的功能障礙［1］。本研究顯示，β-catenin及DKK-1蛋白陽性細胞主要位于精原細胞、睪丸間質(zhì)細胞及生精基膜附近的支持細胞等，影響雄性子鼠的血睪屏障，影響生精細胞粘附和生精細胞功能。β-catenin及DKK-1蛋白陽性細胞計數(shù)結(jié)果顯示，在溶劑對照組中β-catenin蛋白表達較弱，BPA暴露組中β-catenin及DKK-1蛋白表達明顯增強，主要位于精原細胞和睪丸間質(zhì)細胞中，且隨著BPA劑量的增加，陽性細胞數(shù)逐漸增多。表明Wnt／β-catenin信號通路參與了BPA染毒對子鼠雄性生殖細胞的生長和發(fā)育，其具體機制有待進一步闡明。

（致謝：感謝安徽醫(yī)科大學(xué)毒理教研室沈彤博士在實驗造模中給予的幫助）

［1］ Thrasivoulou C，Millar M，Ahmed A.Activation of intracellular calcium by multiple Wnt ligands and translocation of β-catenin into the nucleus：a convergent model of Wnt／Ca2＋and Wnt／β-catenin pathways［J］.J Biol Chem，2013，288（50）：35651－9.

［2］ Liu X L，Chen X Y，Wang Z C，et al.Effects of exposure to bisphenol A during pregnancy and lactation on the testicular morphology and caspase－3 protein expression of ICR pups［J］.Biomed Rep，2013，1（5）：420－4.

［3］ 劉曉利，陳曉宇，李 云，等.出生前后雙酚A暴露對子鼠雄性生殖細胞凋亡的影響［J］.中國臨床解剖學(xué)雜志，2012，30（6）：670－4.

［4］ Arkell R M，F(xiàn)ossat N，Tam P P.Wnt signalling in mouse gastrulation and anterior development：new players in the pathway and signal output［J］.Curr Opin Genet Dev，2013，23（4）：454－60.

［5］ Gaudio A，Privitera F，Pulvirenti I，et al.The relationship between inhibitors of the Wnt signalling pathway（sclerostin and Dickkopf-1）and carotid intima-media thickness in postmenopausal women with type 2 diabetes mellitus［J］.Diab Vasc Dis Res，2014，11 （1）：48－52.

［6］ Hayward P，Kalmar T，Arias A M.Wnt／Notch signalling and information processing during development［J］.Development，2008，135（3）：411－24.

［7］ Martin J，Afouda B A，Hoppler S.Wnt／beta-catenin signalling regulates cardiomyogenesis via GATA transcription factors［J］.J Anat，2010，216（1）：92－107.

［8］ Lyros O，Rafiee P，Nie L，et al.Dickkopf-1，the Wnt antagonist，is induced by acidic pH and mediates epithelial cellular senescence in human reflux esophagitis［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2014，306（7）：G557－74.

［9］ 趙 璇，徐 燕，鄭桂婷，等.氯化鋰介導(dǎo)經(jīng)典Wnt／β-catenin信號通路在大鼠脂肪干細胞增殖和成骨中的作用［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，49（5）：590－4.

［10］Ning B，Wang P，Pei X，et al.Dual function of β-catenin in articular cartilage growth and degeneration at different stages of postnatal cartilage development［J］.Int Orthop，2012，36（3）：655－64.

Proteins expression of β-catenin，DKK-1 in bisphenol A exposure before and after birth on male rat reproductive cells

Yang Xiaosi1，2，Liu Xiaoli1，Song Xianbing1，et al
（1Dept of Histology and Embryology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Human Anatomy，Anqing Medical College，Anqing 246052）

ObjectiveTo explore the proteins expression and significance of β-catenin，DKK-1 in bisphenol A （BPA）exposure before and after birth on male rat reproductive cells.MethodsICR infected pregnant rats drinking water from the conception 0 day（PGD0）were randomly divided into：BPA solvent control group，10 nmol／L，50 nmol／L，300 nmol／L BPA groups.Male young rats were killed in the 6th week（PGD42）after birth，β-catenin and DKK-1 protein expressions in testicular tissue were detected by immune-histochemical stained and Western blot.ResultsCompared with the solvent control group，testicular viscera coefficient in BPA exposure group young mice decreased.Compared with the solvent control group，β-catenin and DKK-1 protein expression in BPA exposure group significantly increased with immunohistochemical results and Western blot.ConclusionThe main proteins of β-catenin，DKK-1 in Wnt／β-catenin signaling pathway proteins may be involved in the BPA exposure before and after birth on male rat reproductive cells.

bisphenol A；β-catenin protein；DKK-1 protein；testicular germ cell

A

1000－1492（2015）07－0929－04

2015－03－22接收

安徽省自然科學(xué)基金項目（編號：1208085MC53）；國家自然科學(xué)基金面上項目（編號：81373421）

1安徽醫(yī)科大學(xué)組胚教研室，合肥 230032

2安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校解剖教研室，安慶 246052

楊小四，男，碩士研究生，講師；陳曉宇，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：chenxy＠ahmed.edu.cn

R 329.24