任 娟，衛(wèi) 兵，宋恩學(xué)，王文艷，張麗麗

生長(zhǎng)激素受體在宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及意義

任 娟，衛(wèi) 兵，宋恩學(xué)，王文艷，張麗麗

目的探討生長(zhǎng)激素受體（GHR）在宮腔粘連（IUA）患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)及意義。方法通過免疫組化MaxVision兩步法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法分別檢測(cè)IUA患者（研究組）和非IUA患者（對(duì)照組）子宮內(nèi)膜組織中GHR蛋白和GHR mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果研究組GHR蛋白表達(dá)、GHR mRNA和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。子宮內(nèi)膜腺體與子宮內(nèi)膜間質(zhì)中GHR蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論IUA患者子宮內(nèi)膜組織中GHR的表達(dá)低于非IUA患者，而且這種表達(dá)在子宮內(nèi)膜腺體中較多，在子宮內(nèi)膜間質(zhì)中較少，為IUA患者在宮腔粘連分離術(shù)術(shù)后使用生長(zhǎng)激素提供一定的理論參考。

宮腔粘連；生長(zhǎng)激素；生長(zhǎng)激素受體

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）臨床主要表現(xiàn)為月經(jīng)量減少甚至閉經(jīng)、周期性下腹痛、不孕、反復(fù)流產(chǎn)、產(chǎn)后胎盤粘連甚至植入等［1］。近年來IUA患病率逐年增加，IUA已嚴(yán)重影響著現(xiàn)代女性的生活質(zhì)量和生育要求。IUA的治療主要包括經(jīng)宮腔鏡下宮腔粘連分離術(shù)［2］（transcervical resection of adhesions，TCRA）和術(shù)后應(yīng)用雌孕激素促子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)。研究［3－4］報(bào)道，生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）在體外受精－胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）中對(duì)反應(yīng)不良性子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜反應(yīng)不良性閉經(jīng)中都有促進(jìn)子宮內(nèi)膜發(fā)育的作用，這些研究均提示GH可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)。部分研究者在此基礎(chǔ)上試圖加用GH來提高IUA治療的效果［5］，但目前關(guān)于GH研究主要偏于臨床，尚缺乏基礎(chǔ)研究的證據(jù)。該研究通過免疫組化MaxVision兩步法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real time-PCR，qRT-PCR）法，研究生長(zhǎng)激素受體（growth hormone receptor，GHR）在IUA和非IUA患者子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況，為IUA患者TGRA術(shù)后使用GH提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 選取2013年11月～2014年5月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院行宮腔鏡檢查并確診為IUA患者28例作為研究組，年齡20～35 （29.62±2.52）歲。同期因其他原因（子宮縱隔、不孕或節(jié)育器嵌頓）行宮腔鏡檢查確診為非IUA患者22例作為對(duì)照組，年齡20～40（28.80±3.34）歲，并且這些非IUA患者既往都有過宮腔操作史。

1.1.2 主要手術(shù)設(shè)備 宮腔鏡及冷光源、腹腔鏡、異物鉗（德國(guó)STORZ公司）；監(jiān)視器（日本SONY公司）；液體膨?qū)m泵（德國(guó)Aesculap公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo公司）；微孔板迷你離心機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.1.3 主要試劑 免疫組化一抗：兔抗人GHR單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；二抗：即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒（鼠／兔）（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；TRIzol試劑和引物（美國(guó)Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司）；QuantiFast SyBr Green PCR kit（德國(guó)Qiagen公司）；核酸染料（上海賽百盛公司）。

1.1.4 術(shù)前準(zhǔn)備 患者空腹?fàn)顟B(tài)于上午9時(shí)前抽取靜脈血檢查GH均未見異常，閉經(jīng)者手術(shù)時(shí)間不受限制，月經(jīng)減少者在卵泡期手術(shù)。

1.1.5 標(biāo)本采集 兩組患者均行宮腔鏡檢查，在檢查中或TCRA操作過程中，視需要在正常子宮內(nèi)膜組織中，用異物鉗鉗取適量（質(zhì)量約20 mg）的內(nèi)膜組織作為標(biāo)本。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 免疫組化MaxVision兩步法 ①取存檔蠟塊，連續(xù)切片4 μm，貼片，65℃溫箱烤片2 h，二甲苯脫蠟；②檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復(fù)，PBS沖洗3次，每次3 min；③免疫組化染色按MaxVision兩步法常規(guī)流程進(jìn)行切片中滴加一抗（兔抗人GHR單克隆抗體以1∶400稀釋），4℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min，去除一抗后滴加二抗，試劑盒37℃溫箱中孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min；④滴加新鮮配制的DAB顯色；⑤清水沖洗，蘇木精淺染，清水沖洗還藍(lán)，梯度乙醇溶液脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，其余操作流程完全相同。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判斷及半定量分析 將制好的切片置顯微鏡下觀察，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)不重疊400倍視野進(jìn)行測(cè)量，陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色或棕褐色，根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)弱將結(jié)果分為弱、中、強(qiáng)三級(jí)，并分別給予1～3分：1分：無(wú)信號(hào)或信號(hào)很弱；2分：信號(hào)中等呈淡黃色或棕黃色；3分：信號(hào)很強(qiáng)呈棕褐色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別給予1～3分：1分：陽(yáng)性率≤20%；2分：陽(yáng)性率21%～70%；3分：陽(yáng)性率71%～100%。上述兩項(xiàng)評(píng)分相加作為每例的總積分。結(jié)果判定：總積分1～2分為陰性（－），3～4分為陽(yáng)性（＋），5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋）。

1.2.3 qRT-PCR法 ①?gòu)淖訉m內(nèi)膜組織中提取RNA：取子宮內(nèi)膜組織約20 mg經(jīng)液氮研磨后加入1 ml TRIzol裂解；加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩；4℃12 000 r／min離心15 min，取上清液，加入等體積異丙醇沉降；4℃、12 000 r／min離心10 min，棄上清液，加入1 ml 75%乙醇溶液；4℃、12 000 r／min離心5 min，棄上清液，干燥RNA沉淀；加入20～50 μl DEPC水，55℃促溶10 min，－80℃保存?zhèn)溆?；②RNA的濃度及純度的測(cè)定：分別測(cè)定光密度（optical density，OD）值OD260和OD280以計(jì)算RNA樣品的濃度和純度；③樣品cDNA合成：在0.2 ml無(wú)RNase PCR管中，加入總RNA（質(zhì)量為2 μg）、10 μmol／L Oligo 1 μl、DEPC水補(bǔ)足至12 μl，輕輕混勻、點(diǎn)動(dòng)離心；PCR儀上65℃加熱5 min，立即冰浴3 min；在0.2 ml無(wú)RNase PCR管中加入5×Reaction Buffer 4.0 μl、10 mmol／L dNTP Mix 2 μl、RibolockTMRnase inhibitor 1 μl、RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcniptase 1 μl；RCR儀上42℃加熱60 min，70℃持續(xù)5 min，取出上述反應(yīng)液，即為cDNA，－80℃保存?zhèn)溆?；④熒光定量PCR反應(yīng)（SYBR GREEN方法）：取出上述反應(yīng)液1 μl作為熒光定量的模板，反應(yīng)體系如下：2×SYBR Green mixture 5 μl、上游引物（10 μmol／L）和下游引物（10 μmol／L）各1 μl、cDNA 1 μl、無(wú)RNA酶水2 μl，總共10 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s、60℃退火、延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)所用人類基因擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用人類基因擴(kuò)增引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)計(jì)量資料采用±s表示。qRT-PCR分析所采用的指標(biāo)為：2－ΔΔCt。計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜腺體與子宮內(nèi)膜間質(zhì)中GHR蛋白表達(dá)水平比較免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示：子宮內(nèi)膜腺體中陽(yáng)性細(xì)胞30例，陰性20例，陽(yáng)性細(xì)胞率為60%；子宮內(nèi)膜間質(zhì)中陽(yáng)性細(xì)胞18例，陰性32例，陽(yáng)性細(xì)胞率為36%；兩部位GHR蛋白比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.769，P＝0.016）。圖1A：PBS陰性對(duì)照，子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均呈陰性表現(xiàn)；圖1B：研究組GHR蛋白陽(yáng)性染色主要定位于子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈淡黃色（＋），而子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（－）；圖1C：對(duì)照組GHR蛋白陽(yáng)性染色定位于子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中（主要定位在細(xì)胞質(zhì)）均呈棕褐色（＋＋）；圖1B和圖1C中GHR蛋白陽(yáng)性染色都呈彌漫性分布，如風(fēng)塵狀。

2.2 研究組和對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織中GHR蛋白表達(dá)水平比較免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示研究組GHR蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組（1.70±0.57 vs 2.77±0.75），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3.373，P＜0.05）。

2.3 研究組和對(duì)照組子宮內(nèi)膜組織中GHR mRNA表達(dá)水平比較qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示研究組（16例）的GHR mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組（14例）（0.64±0.21 vs 1.00±0.33），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.329，P＜0.05）。β-actin、GHR熔解曲線均呈單一峰，并且解鏈溫度在80℃左右，說明產(chǎn)物單一，引物特異性較好，得出的數(shù)據(jù)可信。見圖2。

3 討論

成熟的人GHR分子是一個(gè)含620個(gè)氨基酸的單鏈糖蛋白，其中N端246個(gè)氨基酸含5個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，位于細(xì)胞外，構(gòu)成激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C 端350個(gè)氨基酸位于胞內(nèi)，構(gòu)成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域［6］。GH是由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種單一肽鏈的蛋白質(zhì)激素，是一種具有廣泛生理功能的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素，在女性人體發(fā)育時(shí)和雌激素一起促進(jìn)子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)發(fā)育。GH發(fā)揮功能主要經(jīng)由兩個(gè)途徑：一是誘導(dǎo)肝細(xì)胞、肌細(xì)胞產(chǎn)生生長(zhǎng)介素（somatomedin，SM），再經(jīng)由SM間接起作用；二是直接作用于靶細(xì)胞產(chǎn)生生理效應(yīng)［7］。無(wú)論哪一種方式GH都需要首先同細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，即在生理激素濃度下，1分子GH與2分子GHR相結(jié)合從而導(dǎo)致受體二聚化［8］，再由GHR介導(dǎo)將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂，加速細(xì)胞的增殖，使內(nèi)膜組織增生［9－10］。

正常情況下子宮內(nèi)膜在雌孕激素作用下有很強(qiáng)的再生能力，只要內(nèi)膜基底層不受損傷，或者受損的基底層沒有完全形成粗糙面，受損部位的內(nèi)膜能夠很快再生而修復(fù)。IUA患者的子宮內(nèi)膜基底層嚴(yán)重受損，無(wú)法再生修復(fù)，宮腔部分或全部閉塞，約90%由過度刮宮引起。通過查閱以往的研究［5］，GH研究主要偏于臨床，尚缺乏基礎(chǔ)研究的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)同樣是在有過宮腔操作史造成子宮內(nèi)膜受損和血液中GH水平無(wú)差異的條件下，研究組GHR表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，并且這種表達(dá)在子宮內(nèi)膜腺體中的表達(dá)較多，而在子宮內(nèi)膜間質(zhì)中的表達(dá)較少。這表明GH有可能是通過促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺體的增生和發(fā)育以增強(qiáng)子宮內(nèi)膜的厚度和容受性，從而為IUA患者TCRA術(shù)后加用GH提供了理論依據(jù)，也為臨床應(yīng)用GH治療IVF-ET中對(duì)反應(yīng)不良性子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜反應(yīng)不良性閉經(jīng)提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。但是如果子宮內(nèi)膜腺體中GHR不足、缺乏或變異，單方面提高GH水平并不能提高子宮內(nèi)膜的厚度及容受性，相反超生理劑量的GH對(duì)GHR有反向調(diào)節(jié)作用［11］，過量的GH將會(huì)阻止了受體二聚化和信息傳遞甚至可能會(huì)增加患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)［12］。

綜上所述，研究組GHR表達(dá)水平低于對(duì)照組，可能是由于研究組患者子宮內(nèi)膜組織中的GHR水平較低從而使受損的子宮內(nèi)膜難以修復(fù)或異常修復(fù)；并且GHR蛋白的陽(yáng)性表達(dá)在子宮內(nèi)膜腺體中較多，而在子宮內(nèi)膜間質(zhì)中表達(dá)較少，這表明GH主要是通過與子宮內(nèi)膜腺體中的GHR結(jié)合以促進(jìn)腺體的增生和發(fā)育，達(dá)到促進(jìn)子宮內(nèi)膜增生和發(fā)育的作用。因此臨床使用GH治療IUA時(shí)，要充分考慮到GHR的數(shù)量，可以探索使用其激素受體激動(dòng)劑提高受體的數(shù)量，來調(diào)整藥物在IUA治療過程中使用的劑量，制定符合患者病情的個(gè)體化綜合治療方案，本實(shí)驗(yàn)因收集樣本時(shí)間較短，樣本數(shù)量較少，今后需擴(kuò)大更多的樣本量作進(jìn)一步研究。

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Expression and significance of growth hormone receptor in the endometrial tissue of intrauterine adhesion patients

Ren Juan，Wei Bing，Song Enxue，et al
（Dept of Gynecology and Obstetrics，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the growth hormone receptor（GHR）expression and significance of endometrial tissue in patients with intrauterine adhesions.MethodsImmunohistochemistry MaxVision twostep and quantitative real-time PCR（qRT-PCR）were used to detect the expression of GHR protein and GHR mRNA IUA in patients endometrial tissue of IUA group（study group）and non IUA group（control group）.ResultsUsing immunohistochemistry assay to detect GHR protein expression and qRT-PCR to detect the GHR mRNA expression，and the differences between the study group and the control group were statistically significant（P＜0.05）.Immunohistochemistry was used to detect the expression of GHR protein in endometrial glands and endometrial stromal，the difference between the two parts were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe expression of GHR in endometrial tissue in patients with IUA is lower than those of non-IUA，and this expression is more in endometrial glands，less in endometrial stroma，which provide a theoretical reference for the use of hormone in IUA patients after transcervical resection of adhesions（TCRA）.

intrauterine adhesions；growth hormone；growth hormone receptor

R 711.74

A

1000－1492（2015）07－1004－04

2015－03－20接收

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81100412）

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，合肥 230601

任 娟，女，碩士研究生；衛(wèi) 兵，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：weibing1965＠hotmail.com