張靜 何其瑞 金玉林 周小菊

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLA-B27對(duì)輔助診斷AS作用的評(píng)估

張靜 何其瑞 金玉林 周小菊

目的 評(píng)估流式細(xì)胞術(shù)HLA-B27檢測(cè)對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎(AS)的臨床診斷價(jià)值。方法 對(duì)438例均經(jīng)過X線檢查的患者用流式細(xì)胞儀法進(jìn)行HLA-B27檢測(cè), 計(jì)算各項(xiàng)診斷性能指標(biāo), 并與X線檢查結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)HLA-B27檢測(cè)試驗(yàn)的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度和約登指數(shù)分別為89.3%、93.1%、91.3%、0.824。兩種診斷方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.424＞0.05), 而且吻合度較好(к=0.885＞0.7)。另外有7例(3.5%)AS患者X線檢查正常而HLA-B27陽性。結(jié)論 流式細(xì)胞術(shù)HLA-B27檢測(cè)對(duì)AS的診斷價(jià)值較高, 適合于臨床常規(guī)檢測(cè)。

流式細(xì)胞儀；HLA-B27；強(qiáng)直性脊柱炎；X線檢查

HLA-B27基因是HLA-Ⅰ類分子B位點(diǎn)上一個(gè)重要的等位基因, 位于人類第6號(hào)染色體短臂上。該基因編碼的抗原幾乎表達(dá)在所有有核細(xì)胞上, 尤其淋巴細(xì)胞表面含量最為豐富。HLA-B27分子的免疫功能主要有負(fù)責(zé)細(xì)胞之間的相互識(shí)別, 誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等。早在1973年Brewerton等就發(fā)現(xiàn)HLA-B27表達(dá)與AS關(guān)系密切［1］。后來的研究證實(shí)：HLA-B27抗原表達(dá)與AS呈高度相關(guān)性, 超過90% AS患者HLA-B27抗原陽性［2-4］, 而正常人群HLA-B27陽性率只有5%左右。迄今為止, 在發(fā)現(xiàn)的所有HLA抗原與疾病關(guān)聯(lián)中, HLA-B27與AS的相關(guān)性最強(qiáng)最典型［5］。因此, HLA-B27檢測(cè)對(duì)AS的臨床診斷和鑒別診斷具有重要意義。本院在2007年開展了HLA-B27流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)技術(shù), 至今已檢測(cè)標(biāo)本3000多例。為評(píng)估本院開展的HLA-B27檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)AS的臨床診斷能力, 作者回顧性研究了本院檢測(cè)HLAB27的438例患者病歷資料, 并對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年1～7月本院相關(guān)科室均經(jīng)過X線檢查的438例患者, 男323例, 女115例, 年齡14～57歲, 平均年齡(30.1±9.2)歲。其中, 結(jié)合臨床癥狀和多種檢測(cè)手段最終被醫(yī)師確診為AS的患者201例［男163例, 女38例, 平均年齡(26.4±6.1)歲］, 非AS患者237例。

1.2 儀器與試劑 FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司),配套HLA-B27檢測(cè)試劑盒(包括Anti-HLA-B27 FITC/CD3, HLA-B27 Calibtation beads for FL1, FACS溶血素等)。

1.3 方法 用EDTA抗凝的真空采血管采集2 ml外周血。取50 μl抗凝全血, 加入30 μl Anti-HLA-B27 FITC/CD3混勻,室溫避光靜置15～30 min。加入2 ml用蒸餾水1∶10稀釋的溶血素, 低速混勻, 室溫避光靜置10～12 min后立即300 g離心5 min, 棄上清。加入2 ml PBS, 混勻靜置5 min, 200 g離心后棄上清。加入0.5 ml PBS, 低速混勻, 固定30 min。對(duì)儀器進(jìn)行調(diào)試后啟動(dòng)軟件進(jìn)行樣本HLA-B27的自動(dòng)分析。根據(jù)定標(biāo)微球確定界值, 若樣本FL1平均熒光強(qiáng)度大于或等于界值判斷為陽性, 小于界值為陰性,見圖1, 圖2。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.4.1 為評(píng)價(jià)X線檢查和流式細(xì)胞術(shù)HLA-B27檢測(cè)對(duì)AS的診斷價(jià)值, 以臨床醫(yī)師的最終診斷為金標(biāo)準(zhǔn), 分別計(jì)算該兩種診斷方法的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度和約登指數(shù), 計(jì)算公式如下：

靈敏度=［TP/(TP+FN)］×100% (TP:真陽性數(shù), FN：假陰性數(shù))

特異性=［TN/(TN+FP)］×100% (TN:真陰性數(shù), FP：假陽性數(shù))

準(zhǔn)確度=［(TP+TN)/(TP+TN+FN+FP)］ ×100%約登指數(shù)=靈敏度+特異性-1

1.4.2 用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)資料McNemar檢驗(yàn), 一致性檢驗(yàn)采用к系數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, к≥0.7表示吻合度較強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 201例確診的AS患者中HLA-B27陽性者有184例,陽性率為91.5%。237例非AS患者中HLA-B27陽性者有16例, 陽性率為6.8%。兩種方法各項(xiàng)診斷性能指標(biāo)見表1。

圖1 HLA-B27陽性標(biāo)本

圖2 HLA-B27陰性標(biāo)本

2.2 用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)438例患者進(jìn)行HLA-B27的檢測(cè)結(jié)果與X線檢查比較, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.424＞0.05)；к=0.885＞0.7,說明兩種方法具有較強(qiáng)的吻合性, 見表2。

表1 X線和HLA-B27檢測(cè)方法的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度和約登指數(shù)(n, %)

表2 438例疑似患者HLA-B27檢測(cè)和X線檢查結(jié)果比較(n)

3 討論

AS是一種主要累及脊柱、骶髂關(guān)節(jié)的慢性進(jìn)行性疾病,發(fā)病較為隱匿。AS多見于15～30歲的男性青少年, 男女比例約為3：1［6,7］［本次調(diào)查研究AS平均發(fā)病年齡(26.4±6.1)歲, 男女患病比例約為4.3：1］。雖然其確切病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚, 但許多研究表明遺傳和環(huán)境因素起著至關(guān)重要的作用。臨床診斷AS主要依靠臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查,如X線、CT和MRI等。但由于CT和MRI價(jià)格昂貴等原因, X線檢查仍是該病的基礎(chǔ)診斷方法。中晚期出現(xiàn)骶髂關(guān)節(jié)炎時(shí), X線顯示關(guān)節(jié)邊緣模糊, 并稍致密, 關(guān)節(jié)間隙加寬等。但在發(fā)病初期骶髂關(guān)節(jié)炎的這些表現(xiàn)并不明顯, 因此早期單靠X線難以確診。

HLA-B27抗原是強(qiáng)直性脊柱炎的一個(gè)重要遺傳標(biāo)記。多項(xiàng)家族調(diào)查研究也發(fā)現(xiàn)B27是重要的AS預(yù)判指標(biāo), 因?yàn)锽27陰性個(gè)體患AS的幾率幾乎為零, 而陽性個(gè)體患病幾率達(dá)到20%～30%［8-10］。因此, HLA-B27可以作為常規(guī)篩選指標(biāo),對(duì)AS的診斷、預(yù)防和預(yù)后判斷都有重要意義。目前HLA-B27的常用檢測(cè)方法有ELISA、補(bǔ)體依賴的微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)、PCR和流式細(xì)胞儀法等。其中, 流式細(xì)胞儀法自動(dòng)化程度高,操作簡(jiǎn)便, 重復(fù)性好, 結(jié)果判斷準(zhǔn)確, 是目前比較理想的檢測(cè)方法。BD公司的一份流式細(xì)胞術(shù)臨床研究手冊(cè)表明用流式細(xì)胞儀來檢測(cè)HLA-B27表達(dá)的特異性高達(dá)97.4%。

本實(shí)驗(yàn)采用流式法對(duì)438例患者進(jìn)行HLA-B27檢測(cè),結(jié)果顯示201例AS患者中HLA-B27陽性率為91.5%, 而非AS人群中HLA-B27陽性率僅為6.8%, 與以前的文獻(xiàn)報(bào)道相近［2-4］, 強(qiáng)烈提示HLA-B27抗原表達(dá)與AS密切相關(guān)。經(jīng)計(jì)算流式法 HLA-B27檢測(cè)的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度和約登指數(shù)分別為89.3%、93.1%、91.3%、0.824,各項(xiàng)性能指標(biāo)的整體水平較好, 說明HLA-B27檢測(cè)對(duì)AS的檢出能力較高。經(jīng)配對(duì)資料McNemar檢驗(yàn), P＞0.05, 兩種方法檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 另外經(jīng)к系數(shù)檢驗(yàn), к=0.885＞0.7, 說明兩種方法具有較好的符合率。

另外作者發(fā)現(xiàn)確診的AS患者中有7例(3.5%)X線檢查正常, 但HLA-B27檢測(cè)陽性, 這表明并行HLA-B27檢測(cè)具有重要的臨床意義, 是十分必要的。

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Evaluation of HLA-B27 detection by flow-cytometry for effect of assisted diagnosis of AS

ZHANG Jing, HE Qi-rui, JIN Yu-lin, et al.
Department of Blood Transfusion, Xinyang City Central Hospital, Xinyang 464000, China

Objective To evaluate the clinical diagnosis value of HLA-B27 detection by flowcytometry for ankylosing spondylitis (AS).Methods Flow-cytometry was applied for 438 patients under X-ray examination to detect their HLA-B27.Indicators of diagnostic performance were calculated, and were compared with X-ray examination outcomes.Results The sensitivity, specificity, accuracy, and Youden index of flow-cytometry in detection of HLA-B27 were respectively 89.3%, 93.1%, 91.3%, and 0.824.There was no statistically significant difference between these two diagnosis methods (P=0.424＞0.05), and both methods had good coincidence rate (к=0.885＞0.7).There were another 7 cases (3.5%) with AS had normal result in X-ray examination along with positive HLA-B27.Conclusion Flow-cytometry provides high diagnostic value for AS through its detection of HLA-B27, and it is worth being applied in clinically conventional detection.

Flow-cytometry; HLA-B27; Ankylosing spondylitis; X-ray examination

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.11.008

2014-11-21］

464000 信陽市中心醫(yī)院輸血科