王 靜，王 烜，鄧明明，孟 婭

(1.四川省自貢市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 643000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川瀘州 646000)

論著·基礎(chǔ)研究

HMGB1、TLR4在重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織中的表達(dá)及烏司他丁的干預(yù)效應(yīng)

王 靜1，王 烜2△，鄧明明2，孟 婭2

(1.四川省自貢市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科 643000；2.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，四川瀘州 646000)

目的 探討HMGB1、TLR4在重癥急性胰腺炎大鼠胰腺組織中的作用機(jī)制以及烏司他丁的干預(yù)效應(yīng)。方法 將54只SD大鼠分為對(duì)照組、SAP組和烏司他丁治療組，3組又分為6、12 h和24 h 3個(gè)小組(每小組n=6)。對(duì)照組開(kāi)腹后僅翻動(dòng)胰腺組織，SAP組用5%的?；悄懰徕c制備SAP模型，治療組在SAP造模成功后經(jīng)尾靜脈注射烏司他丁。觀察3組大鼠胰腺組織的病理學(xué)改變；EPS-G7法檢測(cè)血清中的淀粉酶；ELISA法檢測(cè)血清及胰腺組織中的HMGB1；Envision兩步免疫法檢測(cè)胰腺組織中的HMGB1、TLR4的表達(dá)水平。結(jié)果 SAP組、治療組各時(shí)間點(diǎn)的淀粉酶與對(duì)照組比較明顯升高，病理學(xué)改變明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，示SAP造模成功；SAP組在胰腺組織及血清中的HMGB1表達(dá)在6 h開(kāi)始升高，于12 h快速上升，至24 h保持上升趨勢(shì)，與對(duì)照組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組與SAP組相同時(shí)間點(diǎn)的HMGB1比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SAP組胰腺組織中的TLR4表達(dá)在6 h開(kāi)始升高，12 h達(dá)高峰，24 h開(kāi)始下降，與對(duì)照組大鼠相同時(shí)間點(diǎn)比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療組與SAP組相同時(shí)間點(diǎn)的TLR4比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 HMGB1在SAP大鼠胰腺中的致炎作用可能是部分結(jié)合其受體TLR4并通過(guò)MyD88依賴(lài)性途徑而實(shí)現(xiàn)的，而烏司他丁可能是通過(guò)中斷SAP大鼠胰腺組織中的HMGB1、TLR4信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用。

胰腺炎；高遷移率族蛋白-1;Toll樣受體4；烏司他丁

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)來(lái)勢(shì)猛，病死率可高達(dá)20%～30%。SAP確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,近年來(lái)有研究提示作為炎性反應(yīng)啟動(dòng)閘門(mén)的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)[1]及作為晚期炎性介質(zhì)的高遷移率族蛋白-1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)[2]可能通過(guò)某些傳導(dǎo)通路共同參與了SAP的發(fā)生、發(fā)展，而烏司他丁則可通過(guò)抑制炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，從而減輕SAP全身炎性反應(yīng)并降低病死率。本研究試圖通過(guò)SAP大鼠模型及采用烏司他丁干預(yù)，探討HMGBI、TLR-4在SAP大鼠胰腺組織中的表達(dá)及其作用機(jī)制以及烏司他丁對(duì)胰腺組織中的HMGBI、TLR4的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 健康SD大鼠24只(雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量200～250 g)購(gòu)自簡(jiǎn)陽(yáng)達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司；?；悄懰徕c(美國(guó)Sigma公司)；烏司他丁(廣東天普生物化學(xué)制藥有限公司)；大鼠 HMGB1 ELISA試劑盒(上海生工)；大鼠TLR4多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；大鼠HMGB1多克隆抗體(美國(guó)Bioworld公司)。

1.2 動(dòng)物分組及造模 54只SD大鼠分為對(duì)照組、SAP組和治療組，3組又分為6、12 h和24 h 3個(gè)小組(每小組n=6)。術(shù)前12 h及術(shù)后禁食不禁飲。(1)對(duì)照組：常規(guī)備皮、消毒、鋪巾后，予1%戊巴比妥鈉(4 mL/kg)行腹腔注射麻醉后，經(jīng)正中線入腹，開(kāi)腹后僅翻動(dòng)胰腺組織；(2)SAP組：參照Z(yǔ)hang等[3]方法用5%的牛磺膽酸鈉(4 mL/kg)胰腺被膜下注射方法復(fù)制SAP模型；(3)治療組：在SAP造模制備成功后，經(jīng)尾靜脈注射由生理鹽水配制的烏司他丁(5萬(wàn)U/kg)進(jìn)行干預(yù)。

1.3 獲取血清及胰腺組織 于術(shù)后6、12 h和24 h分別處死各組大鼠，剖腹經(jīng)大鼠腹腔下腔靜脈穿刺取血并分離血清，部分血清置于-20 ℃冰箱凍存用于淀粉酶及ELISA檢測(cè)；提取胰腺組織，一份胰腺組織置于 10%中性甲醛中固定用于病理學(xué)檢查；一份置于-80 ℃冰箱凍存用于ELISA檢測(cè)。

1.4 胰腺病理觀察 將標(biāo)本固定、包埋、切片，行HE染色，按Schimidt法[4]進(jìn)行評(píng)分。

1.5 血清EPS-G7、HMGB1及胰腺HMGB1的檢測(cè) EPS-G7法檢測(cè)血清中的淀粉酶，操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，由德國(guó)西門(mén)子全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。ELISA法檢測(cè)血清及胰腺中的HMGB1，操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度(OD)值，根據(jù)樣品OD值算出相應(yīng)HMGB1含量。

1.6 胰腺組織HMGB1、TLR4的蛋白濃度檢測(cè) 免疫組織化學(xué)Envision兩步免疫法檢測(cè)胰腺組織中的HMGB1、TLR4蛋白濃度，免疫組織化學(xué)結(jié)果判定在放大400倍的條件下。以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性，隨機(jī)觀察10個(gè)具有代表性的高倍視野，并根據(jù)HMGB1、TLR4陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例記0～4分：小于5%記0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。

2 結(jié)果

2.1 病理改變 對(duì)照組大鼠胰腺大體及鏡下無(wú)明顯變化；SAP組大體可見(jiàn)胰腺出血、壞死及皂化斑，大量血性腹腔積液，鏡下可見(jiàn)SAP組明顯小葉間水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，片狀出血，胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞，腺泡細(xì)胞壞死明顯。SAP組、治療組Schimidt評(píng)分明顯低于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明SAP建模成功；治療組大體及鏡下較SAP組顯著改善。SAP組及治療組病理改變隨時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)行性加重，24 h均重于12 h，12 h均重于6 h，且各組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各組大鼠胰腺病理評(píng)分見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠胰腺Schimidt評(píng)分比較分，n=6)

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b:P<0.05，與SAP組比較。

2.2 血清淀粉酶測(cè)定 SAP組、治療組血清淀粉酶水平明顯高于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明SAP建模成功；治療組數(shù)值明顯低于SAP組且高于對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 ELISA法檢測(cè)血清及胰腺中的HMGB1 SAP組、治療組的HMGB1水平在6 h開(kāi)始升高，12 h明顯升高，至24 h繼續(xù)上升，各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組各時(shí)間點(diǎn)與SAP組比較降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表 3。

表2 各組大鼠血清淀粉酶變化

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b:P<0.05，與SAP組比較。

2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)胰腺組織中的HMGB1、TLR4表達(dá) HMGB1在對(duì)照組僅少量腺泡細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)表達(dá)，SAP組胰腺腺泡細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)HMGB1強(qiáng)表達(dá)，表達(dá)由強(qiáng)到弱依次為SAP組>治療組>對(duì)照組，從6 h開(kāi)始表達(dá)加強(qiáng)，至24 h持續(xù)上升。TLR4在對(duì)照組胰腺泡細(xì)胞質(zhì)有少量表達(dá)，SAP組TLR4達(dá)陽(yáng)性率顯著高于其他各組，表達(dá)由強(qiáng)到弱依次為SAP組>治療組>對(duì)照組，從6 h開(kāi)始表達(dá)加強(qiáng)，至12 h達(dá)高峰，24 h開(kāi)始降低，見(jiàn)表4。

表3 ELISA中各組不同時(shí)間點(diǎn)血清、胰腺中HMGB1的蛋白濃度

a：P<0.05，與對(duì)照組相同時(shí)間點(diǎn)組比較；b:P<0.05，與SAP組相同時(shí)間點(diǎn)比較。

表4 免疫組織化學(xué)中各組不同時(shí)間點(diǎn)胰腺中HMGB1、TLR4陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分分，n=6)

a：P<0.05，與對(duì)照組比較；b:P<0.05，與SAP組比較。

3 討論

SAP病情重，病死率高，其確切發(fā)病機(jī)制尚未完全明了,因此探討SAP發(fā)病機(jī)制中的信號(hào)傳導(dǎo)通路并中斷該通路具有重要意義。HMGB1是真核細(xì)胞核內(nèi)的非DNA結(jié)合蛋白，分布于胰、肺、肝、腎、淋巴等組織細(xì)胞中。作為晚期炎癥介質(zhì)的HMGB1可通過(guò)多條途徑促使炎性反應(yīng)增強(qiáng)，最終使炎癥失控遷延[5]，Mouri等[6]從基因水平上初步揭示HMGB1與其他炎癥介質(zhì)之間相互加強(qiáng)的分泌效應(yīng)，并由此形成復(fù)雜的分泌調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。當(dāng)細(xì)胞受損或壞死時(shí),核內(nèi)HMGB1釋放到細(xì)胞外,激活炎性及免疫反應(yīng),使單核、巨噬等細(xì)胞分泌促炎因子；而促炎因子反過(guò)來(lái)又促使HMGB1分泌從而形成正反饋環(huán)路,使炎性反應(yīng)加重、放大[7]。HMGB1中最重要的受體是TLRS和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)，Nogueira-Machado等[8]研究證實(shí)HMGB1、TLR、RAGE三者相互作用構(gòu)成了一個(gè)三足鼎立的局面，HMGB1介導(dǎo)的損傷和炎癥在其中起著核心作用，Park等[9]發(fā)現(xiàn)TLR4可作為HMGB1受體與HMGB1結(jié)合，通過(guò)MyD88依賴(lài)性途徑，最終導(dǎo)致NF-κB的移位。TLRs發(fā)現(xiàn)于果蠅，是一類(lèi)天然免疫受體家族，TLRs被認(rèn)為是炎癥瀑鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的閘門(mén)[1]。Zhang等[10]研究證明，LR4在SAP的發(fā)病早期就參與了機(jī)體的免疫反應(yīng)，最終觸發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，以TLR4為靶點(diǎn)控制這種瀑鏈?zhǔn)窖仔苑磻?yīng)的有序性，可能是解決類(lèi)似臨床問(wèn)題的新方向[1]。

在本研究中，SAP組、治療組胰腺組織中HMGB1、TLR4的表達(dá)均較對(duì)照組明顯上調(diào)，胰腺組織病理評(píng)分(Schimidt評(píng)分)也高于對(duì)照組，表明SAP胰腺損傷與HMGB1、TLR4的異常表達(dá)有關(guān)，其機(jī)制可能是TLR4可作為HMGB1受體與HMGB1結(jié)合，并可能通過(guò)以MyD88依賴(lài)性途徑及TRIF依賴(lài)性途徑誘導(dǎo)TNF-α、NF-κB等炎癥因子的釋放[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1表達(dá)上升比TRL4晚：胰腺中和血清及胰腺組織中的HMGB1數(shù)據(jù)都提示，從6 h開(kāi)始表達(dá)加強(qiáng)，至24 h持續(xù)上升，進(jìn)一步證明HMGB1可能是晚期炎癥介質(zhì)；而用免疫組織化學(xué)檢測(cè)胰腺中的TLR4，發(fā)現(xiàn)從6 h開(kāi)始表達(dá)加強(qiáng)，至12 h達(dá)高峰，到24 h開(kāi)始降低，則進(jìn)一步證明TLR4可能是炎性反應(yīng)啟動(dòng)閘門(mén)。

烏司他丁是一種單鏈多肽糖蛋白，對(duì)胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等多種酶有抑制作用，還具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，并通過(guò)阻斷蛋白酶所介導(dǎo)的中性細(xì)胞聚集，清除氧自由基，抑制炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放[11]，減輕SAP中SIRS并預(yù)防MODS的發(fā)生。劉淑霞等[12]研究證實(shí)HMGB1在小鼠狼瘡性腎炎中的致炎作用可能部分通過(guò)結(jié)合其受體TLR2,激活NF-κB信號(hào)途徑而實(shí)現(xiàn)的；米亞英等[13]實(shí)驗(yàn)證明類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清 HMGB1 及外周血單核細(xì)胞表面TLR2、TLR4 的表達(dá)可能與類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，且具協(xié)同作用；楊野等[14]實(shí)驗(yàn)顯示HMGB1作為晚期炎癥介質(zhì)可能參與了SAP肝損傷的病理生理過(guò)程；向珂等[15]實(shí)驗(yàn)證明NF-κB及TLR4在SAP發(fā)病機(jī)制中具有重要樞紐作用，烏司他丁腹腔灌洗能減輕胰腺組織及全身的損害。本研究中，治療組胰腺組織中HMGB1、TLR4的表達(dá)均較SAP組明顯減輕，血清淀粉酶、胰腺組織病理評(píng)分也明顯低于SAP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明烏司他丁能顯著改善SAP嚴(yán)重程度。

綜上所述，HMGB1在SAP大鼠胰腺中的致炎作用可能是部分結(jié)合其受體TLR4并通過(guò)MyD88依賴(lài)性途徑而實(shí)現(xiàn)的，而烏司他丁可能是通過(guò)中斷SAP大鼠胰腺組織中的HMGB1、TLR4信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用。因此，以HMGB1及其受體TLR4為治療靶點(diǎn)，通過(guò)中斷HMGB1、TLR4通路，可望用于治療SAP。

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The expression of HMGB1 and TLR4 in pancreatic tissue of rats with severe acute pancreatitis and the intervention effects of Ulinastatin

WangJing1,WangXuan2△,DengMingming2,MengYa2

(1.DepartmentofGastroenterology,theFirstPeople′sHospitalofZigongCity,Zigong,Sichuan643000,China;2.DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the mechanism of HMGB1 and TLR4 in pancreatic tissue of rats with severe acute pancreatitis and the intervention effect of Ulinastatin.Methods The 54 SD rats were completely random divided into control group,SAP group and Ulinastatin treatment group,and each group was divided into three groups:6,12 h and 24 h groups (each groupn=6).In control group,we turned the pancreatic tissue,in SAP group,the SAP model was made with 5% taurocholic acid;and in the treatment group,and intravenous injection of ulinastatin was conducted after the SAP model was successfully made.Then we observed the pancreatic tissue pathology in the three groups.The amylase in serum was detected by EPS-G7 assay,the HMGB1 in serum and pancreatic tissue was detected by ELISA assay,the expression levels of HMGB1 and TLR4 in pancreatic tissue were detected by Envision two-step immunoassay.Results Compared with control group,the amylase of each time point in SAP group and treatment group were significantly higher,and the pathology changed obviously (P<0.05),and the SAP model was successfully made.The HMGB1 expression in pancreatic tissue and serum started increase at 6 h,increased quickly at 12 h and maintained the increasing trend to 24 h in SAP group and it was significantly higher at the same time point compared with that of control group (P<0.05);at the same time point,the HMGB1 in treatment group was significantly lower than that of SAP group (P<0.05);in SAP group,the expression of TLR4 in pancreatic tissue started increasing at 6 h,reached its peak at 12 h and started decreasing at 24 h,it was significantly higher than the control group at the same time point (P<0.05).At the same time point,the TLR4 was significantly lower in the treatment group than SAP group (P<0.05).Conclusion The proinflammatory effect of HMGB1 in SAP rats pancreatic could be partly combine its receptor TLR4 and MyD88-dependent pathway through implementation,and the protecting mechanism of Ulinastatin could be interrupt the HMGB1 and TLR4 signaling pathway in SAP rats pancreatic tissue.

pancreatitis;high mobility group box 1 protein;Toll-like receptors 4;Ulinastatin

王靜(1975-),主治醫(yī)師，碩士，主要從事胰腺炎研究?！?/p>

,E-mail：wang_xuan-niu73@sina.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.04.006

R57

A

1671-8348(2015)04-0450-03

2014-07-03

2014-09-18)