張立峰

邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥劑教研室，河北 邢臺(tái)054000

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定清熱止嚏顆粒中黃芩苷、芍藥苷和葛根素

張立峰

邢臺(tái)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥劑教研室，河北 邢臺(tái)054000

目的：建立清熱止嚏顆粒中黃芩苷、芍藥苷和葛根素含量的測(cè)定方法。方法：采用反相高效液相色譜法，色譜柱為Kromasil-C18(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液(20：80)，采用等度洗脫，改變體積流量以及波長(zhǎng)：在1～12分鐘內(nèi)，流量1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；在12.01～20.0分鐘，流量1.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm；柱溫為30℃，進(jìn)樣量20μL。結(jié)果：黃芩苷、芍藥苷和葛根素線性范圍分別為6～100μg/mL、30～350μg/mL、12～150μg/mL；平均回收率分別為100.3%，99.91%和99.93%;RSD為0.54%、0.47%和0.48%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，可用于清熱止嚏顆粒中黃芩苷、芍藥苷和葛根素的定量測(cè)定。

清熱止嚏顆粒；黃芩苷；芍藥苷；葛根素；高效液相色譜

清熱止嚏顆粒是由黃芩、赤芍、葛根、生地黃、知母、紫草、牡丹皮等12味藥材經(jīng)過(guò)提取加工而制成的復(fù)方制劑，具有清熱涼血，祛風(fēng)止嚏的功效。適用于過(guò)敏性鼻炎證屬郁熱內(nèi)蘊(yùn)者。該產(chǎn)品根據(jù)驗(yàn)方“清熱止嚏湯”改變劑型而研制。方中使用已廣泛應(yīng)用于內(nèi)科臨床方中的葛根、黃芩清陽(yáng)明之郁熱，為君藥；赤芍、牡丹皮、生地黃、紫草清熱涼血而化瘀，有抗變態(tài)反應(yīng)之效而利于調(diào)節(jié)免疫功能，為臣藥［1-3］；為嚴(yán)格控制產(chǎn)品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定黃芩苷、芍藥苷和葛根素，為該產(chǎn)品質(zhì)量控制提供可靠、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 高效液相色譜儀系統(tǒng)包括S P8810型輸液泵、S P8450型紫外可見(jiàn)檢測(cè)器(美國(guó)光譜物理公司提供)、H W-2000色譜工作站(南京千譜軟件有限公司提供)；R h eody n e 7125i型六通進(jìn)樣閥(美國(guó)羅丹妮公司提供)。黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)：111698-200803)，芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：110736-201105)，葛根素對(duì)照品(批號(hào)：110752-201011)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈(色譜純，天津博歐特化工貿(mào)易有限公司提供)。水為超純水，其他試劑均為分析純。清熱止嚏顆粒(河北國(guó)金藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：20130220，20130301，20130310)。

1.2 方法與結(jié)果

1.2.1 色譜條件 色譜柱采用 Kromas i l-C18(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相選用乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80)。等度洗脫，在規(guī)定時(shí)限內(nèi)改變流量和波長(zhǎng)：在1～12分鐘內(nèi)流量采用1.0m L/m in，檢測(cè)波長(zhǎng)230 n m；在12.01～20.0分鐘內(nèi)流量采用1.5m L/m in，檢測(cè)波長(zhǎng)278 n m；柱溫為30℃，進(jìn)樣量20μL。

1.2.2 溶液的制備 精密稱取黃芩苷、芍藥苷和葛根素對(duì)照品適量，置同一量瓶中，加流動(dòng)相配制成每1m L含黃芩苷、芍藥苷和葛根素分別為200μg、600μg和400μg的混合對(duì)照品溶液。取清熱止嚏顆粒15 g，精密稱定，放置到索氏提取器中，加入45%乙醇溶液200 m L提取2小時(shí)，提取液置100m L量瓶中加45%乙醇至刻度，搖勻，精密取1m L置10m L量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即可。按清熱止嚏顆粒制備工藝，制成缺黃芩、赤芍、葛根的陰性樣品，制得陰性供試品溶液。

1.2.3 專屬性試驗(yàn) 在“1.2.1項(xiàng)”色譜條件下，葛根素、芍藥苷和黃芩苷的保留時(shí)間分別為：3.98分鐘、8.01分鐘和15.64分鐘。葛根素與芍藥苷以及芍藥苷與黃芩苷的分離度分別為7.43和4.51，陰性對(duì)照無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

1.2.4 線性關(guān)系 精密量取混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、8 m L，分別置10 m L量瓶中，流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80、160μg/m L黃芩苷，30、60、120、240、480μg/m L芍藥苷和20、40、80、160、320μg/m L葛根素的系列混合對(duì)照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)色譜條件，各精密吸取20μL，分別注入色譜儀，記錄色譜圖及峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X，μg/m L)為橫坐標(biāo)，得回歸方程：

Y=768.82X-289.28(r=0.999 9)，

Y=264.34X+704.24(r=0.999 9)，

Y=6.48X+648.64(r=0.999 9)。

黃芩苷在6～100μg/m L，芍藥苷在30～350μg/m L，葛根素在12～150μg/m L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

1.2.5 精密度試驗(yàn) 上述混合對(duì)照品溶液，精密量取1m L置10m L量瓶中，采用流動(dòng)相稀釋至刻度，在相同條件下重復(fù)測(cè)定5次，20μL/次，其保留時(shí)間穩(wěn)定，記錄峰面積，并計(jì)算R S D(n=5)分別為0.97%、0.67%、1.02%，表明儀器精密度良好。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)20130220的清熱止嚏顆粒按“1.2.2”項(xiàng)下制備得供試品溶液，分別在0、4、8、12、24小時(shí)進(jìn)樣20μL，測(cè)定黃芩苷、芍藥苷和葛根素的峰面積，其R S D分別為0.64%、0.67%和0.38%。表明供試品溶液在室溫下內(nèi)穩(wěn)定性良好，可滿足測(cè)定要求。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同批次清熱止嚏顆粒，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制得6份平行的供試品溶液，分別進(jìn)樣20.0μL，記錄色譜圖，測(cè)得黃芩苷、芍藥苷和葛根素含量的R S D值分別為0.2%、0.3%和0.4%。表明本方法重復(fù)性良好。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知黃芩苷、芍藥苷和葛根素的樣品，分別加入一定量的黃芩苷、芍藥苷和葛根素，測(cè)定黃芩苷、芍藥苷和葛根素，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1—3。

1.2.9 樣品的測(cè)定 取3個(gè)不同批號(hào)的樣品，按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表1 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 芍藥苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表3 葛根素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表4 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

2 討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本研究中，3種有效成分黃芩苷、芍藥苷和葛根素分別在278、230 n m和250 n m處有最大吸收波長(zhǎng)。使用單一的波長(zhǎng)是不可行的。發(fā)現(xiàn)芍藥苷在230 n m波長(zhǎng)處有最大吸收，同時(shí)也能更好地被葛根素再次吸收，因此選擇在230 n m處檢測(cè)和測(cè)定葛根素和芍藥苷，在278n m處檢測(cè)和測(cè)定黃芩苷。

2.2 流動(dòng)相的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)［4-13］選擇不同的流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸（20∶80）為流動(dòng)相，同時(shí)改變流量進(jìn)行洗脫，黃芩苷、芍藥苷與葛根素的分離度好，且出峰時(shí)間合適故選此做為定量測(cè)定的流動(dòng)相。

2.3 提取溶劑的選擇 在組分前處理研究中，使用30%、45%、55%乙醇作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)45%乙醇的提取率最好，雜質(zhì)較少，最終選擇45%的乙醇作為提取溶劑。

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Sim ultaneousDeterm ination of Baisalin,Paeoniflorin and Puerarin in QingRe ZhiTi Granulesby RP-HPLC

ZHANG Lifeng
Pharmacy Teaching and Research Section of XingtaiMedical College,Xingtai054000,China

Objective:To establish amethod fordetection ofbaisalin,paeoniflorin and puerarin in QingRe Zhi－Ti granules.Methods:Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography(RP-HPLC)wasapplied w ith Kromasil-C18as chromatographic column(150mm×4.6mm,5μm)and acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution(20∶80)asmobile phase.Volume flow and wavelength varied w ith isocratic elution.Set flow rate as 1.0m L perminute and wavelength as230 nm in 1 to 12minutes;set flow as 1.5m L perminute and wavelength as 278 nm in 12.01 to 20.0m inutes.The column temperature was set at 30℃and injection volume was 20μL.Results:Linear ranges of baisalin,paeoniflorin and puerarinwere 6～100μg/m L,30～350μg/m L,12～150μg/m L respectively;averages recoverieswere 100.3%,99.91%and 99.93%;RSD were 0.54%,0.47%and 0.48%.Conclusion:Themethod is accurate, convenient,and reproducible for determination ofbaisalin,paeoniflorin and puerarin in QingRe ZhiTi granules.

QingRe ZhiTi granules;baisalin;paeoniflorin;puerarin;high performance liquid chromatography

R257

A

1004-6852(2015)04-0027-03

2014-07-11

張立峰(1975—)，男，碩士學(xué)位，副教授。研究方向：藥物分析、藥學(xué)質(zhì)量及教學(xué)。