郭禹彤，彌 宏，趙宏峰

1長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院

RP-HPLC法測(cè)定制劑中五味子醇甲、五味子甲素與五味子乙素的含量*

郭禹彤1，彌 宏2△，趙宏峰2

1長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117；2吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院

目的：用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定解酒保肝顆粒中五味子醇甲、五味子甲素與五味子乙素含量。方法：采用Apol lo-C18(250mm×4.6mm，5.0μm)柱，以甲醇-水梯度洗脫，流速1.0mL/min，柱溫35℃，檢測(cè)波長254 nm。結(jié)果：五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素分別在40分鐘內(nèi)達(dá)基線分離，線性關(guān)系良好(r≥0.999 7)。加樣回收率分別為97.79%、98.53%和98.17%。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可作為解酒保肝顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

解酒保肝顆粒；高效液相色譜法；五味子醇甲；五味子甲素；五味子乙素

解酒保肝顆粒主要是我實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的一款具有解酒、護(hù)肝等功效的保健食品。由五味子、姜黃等幾味中藥提取而成，用于化學(xué)性肝損傷的輔助保護(hù)以及緩解因酒醉而引發(fā)的各種身體不適癥狀。制劑主要有效成分為五味子甲素，乙素等木脂素類化合物。近年來，采用HP L C法測(cè)定五味子及其制劑中有效成分的研究報(bào)道較多，實(shí)驗(yàn)中多采用等度洗脫測(cè)定單種成分，線性范圍較窄，且分析時(shí)間較長［1-2］。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水梯度洗脫對(duì)解酒保肝顆粒中五味子醇甲、乙素、甲素的含量進(jìn)行了測(cè)定，建立了有效控制解酒保肝顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的方法。為以五味子提取物入藥的制劑的質(zhì)量控制提供了新的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 L C-10A T高效液相色譜儀(日本島津公司提供)；S PD-10A V P紫外檢測(cè)器 (日本島津公司提供)；C sc h rom P l u s色譜工作站(美國奧泰公司提供)；B T125D電子分析天平(瑞士梅特勤公司提供)；KP3200型超聲清理器(北京市永光明醫(yī)療器械有限公司提供)。

1.2 試藥 解酒保肝顆粒(自制，批號(hào)：121001、121002、121003)，對(duì)照品(五味子醇甲，批號(hào)：110857-200406；五味子甲素，批號(hào)：110765-200710；五味子乙素，批號(hào)：110764-201111)，均購自中國食品藥品檢定研究院)，甲醇(色譜級(jí)，美國F i s h er公司)，純化水，其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件［3-4］色譜柱：A p o l l o-C18(250mm× 4.6mm，5.0μm)；流動(dòng)相：甲醇為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按下表中規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0 m L/m in，檢測(cè)波長254 n m，柱溫35℃。理論板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

表1 流動(dòng)相條件

1.3.2 溶液制備

1.3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1m L分別含五味子醇甲0.36mg、五味子甲素0.114mg、五味子乙素0.12mg的混合溶液，過0.22μm濾膜，即得。

1.3.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約1.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入20m L甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30分鐘，放冷后再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2.3 陰性溶液的制備 取除五味子的處方，采用“1.3.2.2”項(xiàng)完全相同的制備方法制備成缺五味子的陰性供試品，即得。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 色譜圖分析 以上各種樣品按照“1.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣10μL。在此條件下，對(duì)照品色譜中五味子醇甲、甲素和乙素色譜峰峰型較好，保留時(shí)間分別為8.63、26.11、34.14分鐘。見圖1。在供試品色譜中，在與五味子醇甲、甲素和乙素對(duì)照品色譜相同的保留時(shí)間處有色譜峰，并與其他組分基本達(dá)到基線分離。見圖2。而在陰性色譜中，在五味子醇甲、甲素、乙素相應(yīng)的保留時(shí)間處沒有色譜峰，說明陰性樣品溶液無干擾。見圖3。

圖1 對(duì)照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

圖3 五味子陰性色譜圖

2.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品混合液3、7、10、13、16μL進(jìn)樣。以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。五味子醇甲：Y=1 142 842.037X-264 449.333 3，R=0.999 97，線性范圍為1.44～5.76μg；五味子甲素：Y=1298361.696X-95489.53333，R=0.9997，線性范圍為0.456～1.824μg；五味子乙素：Y= 1 068 336.111X-86 222.933 3，R=0.999 97，線性范圍為0.48～1.92μg，結(jié)果表明五味子醇甲、甲素、乙素在線性范圍內(nèi)線性良好。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10μL，相同條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果五味子醇甲、甲素、乙素峰面積的R S D分別為1.07%、0.38%、0.21%，表明該方法有良好的精密度。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8、10小時(shí)重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定。以五味子醇甲、甲素、乙素峰面積計(jì)算，R S D分別為0.54%、 0.85%、1.28%，表明供試品溶液在室溫下放置10小時(shí)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)(121001)供試品6份，按照“1.3.2.2”項(xiàng)供試品溶液的制備方法操作并測(cè)定，結(jié)果制劑中五味子醇甲平均含量為5.76mg/g，R S D為0.82%，五味子甲素平均含量為1.20mg/g，R S D為1.09%，五味子乙素平均含量為1.92mg/g，R S D為0.97%表明本方法重復(fù)性較好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取重現(xiàn)性同批次樣品(批號(hào)：121001；其中五味子醇甲5.76mg/g，五味子甲素1.20mg/g，五味子乙素1.92mg/g)6份，分別精密加入對(duì)照品適量，采用加樣回收法測(cè)定五味子醇甲、甲素、乙素回收率。結(jié)果見表2。

2.7 樣品測(cè)定 按照含量測(cè)定項(xiàng)下方法，測(cè)定了3批“解酒保肝顆?！敝?種成分的含量，結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 流動(dòng)相的考察 本研究曾采用藥典［1］中五味子醇甲含量測(cè)定方法以甲醇-水(65∶35)為流動(dòng)相對(duì)本制劑進(jìn)行等度洗脫。結(jié)果表明3種成分雖能達(dá)到基線分離，但由于出峰時(shí)間過長，分析一個(gè)樣品需要80分鐘，故不適于本制劑樣品的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)中也曾按照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)》中五味子醇甲、甲素和乙素的高效液相色譜測(cè)定方法［5］，以甲醇-水(77∶23)為流動(dòng)相對(duì)本制劑樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果五味子醇甲峰分離度不高，與其前后雜質(zhì)峰有干擾。故最終確定以本文所用的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，圖譜中3個(gè)成分的色譜分離度和峰型均較好，且在38分鐘內(nèi)洗脫完畢，大大節(jié)省了分析時(shí)間。

3.2 色譜柱的考察 分別對(duì)色譜柱為a：A l l t ima T M C18；b：A p o l l o-C18和c：P h e n ome n e x L u n a C18柱進(jìn)行考察，結(jié)果表明色譜柱a和c對(duì)五味子醇甲峰分離度不好，拖尾。而采用色譜柱b時(shí)五味子醇甲、甲素、乙素分離度均較好，故選擇色譜柱b為本含量測(cè)定的色譜柱。

3.3 檢測(cè)波長的確定 比較了兩種不同檢測(cè)波長［6-8］對(duì)圖譜的影響，結(jié)果表明230 n m處，五味子醇甲與后雜質(zhì)峰分離效果不好，且峰型較寬。在254 n m處各峰峰形良好，分離度高，基線平穩(wěn)。

本文建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方制劑中五味子醇甲、五味子甲素與五味子乙素3種成分的含量測(cè)定的方法。方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為藥品及保健食品等復(fù)方制劑中五味子藥材的質(zhì)量控制方法。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：二部［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010：337-340.

［2］ 馮華，張超云，鄒孔強(qiáng).HPLC色譜法測(cè)定棗仁安神片中五味子醇甲的含量［J］.中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，15(1)：82-84.

［3］ 李寶，王春輝.HPLC法測(cè)定五味子浸膏中三種成分的含量［J］.黑龍江醫(yī)藥，2009，4(22):436.

［4］ 李慧，肖佳尚.RP-HPLC法測(cè)定復(fù)方五味子膠囊中五味子甲素的含量［J］.中國實(shí)用醫(yī)藥，2008，3(21):36-38.

［5］ 國家中醫(yī)藥管理局.保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)［M］.北京:清華同方電子出版社，2003：1-12.

［6］ 周瑩，程海燕.高效液相色譜法鑒別南北五味子［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2005，24(10):915-916.

［7］ 王金鳳，于源華，蔡林君，等.不同產(chǎn)地五味子HPLC指紋圖譜分析［J］.長春理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，29(3):69-71.

［8］ 趙艷玲，孔維軍，山麗梅，等.HPLC法測(cè)定南北五味子中五味子甲素和五味子酯甲的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2008，9(4):436-437.

△通訊作者：張宏(1970—)，碩士研究生導(dǎo)師，研究員。研究方向：藥物化學(xué)研究。

D etection of Schizandrol A,Schizandrin A and Schizandrin B in JieJiu BaoGan Granulesby RP-HPLC

GUO Yutong1,MIHong2△,ZHAO Hongfeng2
1 Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China; 2 Jilin Science Academy of Traditional Chinese Medicine

Objective:To establish amethod for detection of schizandrol A,schizandrin A and schizandrin B in JieJiu BaoGan granulesby high performance liquid chromatography(HPLC).Methods:Apollo-C18(250mm×4.6mm, 5.0μm)column wasapplied by a gradientelution using acetonitrile-water,w ith flow rate at1.0m L perm inute,column temperature at35℃and wavelength of 254 nm.Results:Baseline separation of schizandrol A,schizandrin A and schizandrin B achieved within 40minutes,and the linear relations between them were excellent(r≥0.9997). The average recoverieswere 97.79%,98.53%and 98.17%respectively.Conclusion:Themethod,which is of accuracy,convenience,highsensitivityand repeatability,canbeusedasqualitycontrolstandard for JieJiu BaoGan granules.

JieJiu BaoGan granules;high performance liquid chromatography;schizandrolA;schizandrin A; schizandrin B

R284.1

A

1004-6852(2015)04-0033-03

2014-07-21

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)20130206024YY)。

郭禹彤(1988—)，女，在讀碩士研究生。研究方向：中藥藥物制劑。