李曉非，梁桂亮，普 冬，楊冬梅，趙 旻

（1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，湖北武漢430071；2.昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明650000）

基因芯片技術(shù)在分枝桿菌菌種鑒定和結(jié)核耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用及評(píng)價(jià)

李曉非1，2，梁桂亮2，普 冬2，楊冬梅2，趙 旻1＊

（1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系，湖北武漢430071；2.昆明市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明650000）

目的探討基因芯片技術(shù)在結(jié)核病快速診療中的應(yīng)用價(jià)值。方法對(duì)抗酸染色涂片陽(yáng)性的肺結(jié)核患者痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行基因芯片菌種鑒定和BACTEC MGIT 960培養(yǎng)，對(duì)結(jié)核陽(yáng)性的樣本分別用以上兩種方法檢測(cè)利福平和異煙肼的耐藥性。以培養(yǎng)法為參考方法，評(píng)價(jià)基因芯片法菌種鑒定和耐藥檢測(cè)的敏感度、特異度和符合率。采用Kappa檢驗(yàn)分析兩種方法的一致性。結(jié)果656例涂片陽(yáng)性的患者中，兩種方法各檢出非結(jié)核分枝桿菌21例，符合率為100%。耐藥性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基因芯片對(duì)利福平的敏感度為87.8%（86／98），特異度為96.0%（410／427），符合率為94.5%（496／525），Kappa值為0.84，P＞0.05；對(duì)異煙肼的敏感度為81.9%（96／116），特異度為91.7%（375／409），符合率為89.5%（470／525），Kappa值為0.71，P＞0.05；兩種藥物藥敏結(jié)果總符合率為92.0%（966／1 050）。結(jié)論基因芯片技術(shù)能夠準(zhǔn)確地篩選出非結(jié)核分枝桿菌；對(duì)利福平和異煙肼耐藥性檢測(cè)與培養(yǎng)法有很好的符合率和高度一致性，而且能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性，在結(jié)核病的快速診療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

基因芯片；分枝桿菌；結(jié)核；檢測(cè)；符合率；利福平；異煙肼

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0204）

結(jié)核病是一種由結(jié)核分枝桿菌（MTB）感染引起的嚴(yán)重危害人類健康和生命的傳染病，是全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，也是造成人類死亡最多的疾病之一［1］。結(jié)核疫情由于疫苗和藥物的使用曾一度得到較好的控制，但近年來(lái)伴隨HIV感染的流行、MTB耐藥菌株的出現(xiàn)以及人口流動(dòng)的增加，全球疫情又急劇惡化。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，結(jié)核病人數(shù)位居世界第二位，僅次于印度［2］。一直以來(lái)困擾結(jié)核病防治的難點(diǎn)：一是不能有效地檢出結(jié)核菌，不利對(duì)患者的及時(shí)正確救治；二是對(duì)患者用藥的耐藥情況不能及時(shí)檢測(cè)，不能做到針對(duì)性的聯(lián)合用藥治療。傳統(tǒng)的檢測(cè)手段已不能滿足臨床需求。隨著90年代以來(lái)生物芯片技術(shù)不斷研究，基因芯片技術(shù)也開始應(yīng)用到分枝桿菌的檢測(cè)中［3，4］。與傳統(tǒng)方法相比，生物芯片技術(shù)具有快速、結(jié)果可靠、重復(fù)性好、通量高、可以在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)成千基因表達(dá)的特點(diǎn)，為分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷開拓新途徑。為探討基因芯片技術(shù)在結(jié)核病快速診療中的應(yīng)用價(jià)值，筆者就我院近期檢測(cè)的情況進(jìn)行以下統(tǒng)計(jì)分析。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2013年1月至12月本院結(jié)核科涂陽(yáng)肺結(jié)核住院患者656例納入觀察。每例患者采集清晨第一口痰2－5ml吐入無(wú)菌容器內(nèi)及時(shí)送檢，同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)和基因芯片檢測(cè)。質(zhì)控菌株購(gòu)自美國(guó)國(guó)家菌種保存中心，共18株：結(jié)核分枝桿菌H37Rv（ATCC27294）、結(jié)核分枝桿菌（ATCC25177）、胞內(nèi)分枝桿菌（ATCC13950）、鳥分枝桿菌（ATCC25291）、龜分枝桿菌（ATCC35752）、膿腫分枝桿菌（ATCC19977）、戈登分枝桿菌（ATCC14470）、偶然分枝桿菌（ATCC6841）、不產(chǎn)色分枝桿菌（ATCC19530）、堪薩斯分枝桿菌（ATCC12478）、淺黃分枝桿菌（ATCC43903）、金色分枝桿菌（ATCC19527）、瘰疬分枝桿菌（ATCC19981）、土地分枝桿菌（ATCCl5755）、草分枝桿菌（ATCC11758）、潰瘍分枝桿菌（ATCC19423）、蟾蜍分枝桿菌（ATCC19250）、恥垢分枝桿菌（ATCC19420）。

1.2 儀器和試劑

BACTEC MGIT 960結(jié)核培養(yǎng)儀及配套試劑由美國(guó)BD公司生產(chǎn)；結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑（膠體金法）由杭州創(chuàng)新生物檢驗(yàn)技術(shù)公司生產(chǎn)；基因芯片檢測(cè)平臺(tái)及配套試劑：為北京博奧生物有限公司研制開發(fā)。

1.3 方法

同一份痰標(biāo)本加入等量0.5%N－乙酰半胱氨酸和氫氧化鈉（NALC－NaOH）前處理液，漩渦振蕩液化15－20min，吸取1m1消化液于1.5ml離心管中，用于基因芯片檢測(cè)，剩余樣本用于結(jié)核培養(yǎng)。核酸擴(kuò)增：1ml液化好的痰液轉(zhuǎn)入潔凈離心管中，12 000rpm離心5min，棄上清在離心管中加1ml洗液，漩渦振蕩混均后12 000rpm離心5min，棄上清（洗液為EDTA或生理鹽水），向離心管加入80μl核酸提取液，漩渦振蕩混均后轉(zhuǎn)入核酸提取管中，使用晶芯Extractor TM 36核酸快速提取振蕩5min將核酸提取管置于95℃水浴5min取出核酸提取管，5 000rpm離心1min。試劑盒B部分取出“PCR擴(kuò)增試劑1、2、3”解凍搖勻后分裝18μl反應(yīng)體系中加入2μl模板溶液，按分枝桿菌菌種鑒定PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。雜交：試劑盒B部分中取出“雜交緩沖液”，50℃熱浴10min，PCR產(chǎn)物置于PCR儀中95℃變性5min，隨后立即置于冰水混合物中驟冷冰浴3min，取出PCR產(chǎn)物，按照9 μl雜交緩沖液、6μl PCR產(chǎn)物的比例配制雜交混合物，按照雜交盒（兩端底部各加100μl蒸餾水）、托架、芯片、蓋片順序裝配好雜交反應(yīng)盒，吸取13.5μl雜交混合物經(jīng)加樣孔加入芯片點(diǎn)陣中，蓋好盒蓋并使用金屬封條密封雜交盒，50℃預(yù)熱BioMixerTMⅡ芯片雜交儀20min以上，完成后將雜交盒平穩(wěn)放入雜交儀托盤，并注意將3只或6只雜交盒全部放入，以使托盤平衡，運(yùn)行分枝桿菌菌種鑒定芯片雜交程序，雜交條件為50℃雜交2h，轉(zhuǎn)速為5rpm。洗干機(jī)洗液配制、洗滌和干燥：從試劑盒A部分中取出洗液原液（20×SSC、10%SDS）配制洗液Ⅰ→依次將20×SSC、蒸餾水、10%SDS按照10∶88∶2比例加入并混合；洗液Ⅱ→將20×SSC、蒸餾水按照1∶99的比例混合。預(yù)熱SlideWasher TM 8芯片洗干儀，進(jìn)行洗滌甩干。結(jié)果判讀：開啟掃描儀，運(yùn)行分枝桿菌菌種鑒定芯片判別系統(tǒng)，預(yù)熱激光10min。將完成洗滌、甩干的芯片插入掃描儀插槽內(nèi)，詳細(xì)記錄判讀結(jié)果和芯片信息。使用結(jié)核耐藥檢測(cè)芯片判別系統(tǒng)對(duì)核酸提取、擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行判讀。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Kappa檢驗(yàn)評(píng)價(jià)兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性，Kappa值0.41－0.60具有中度一致性，0.61－0.8具有高度一致性，0.8l－1.0具有最強(qiáng)一致性。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)一般情況

在所有進(jìn)行培養(yǎng)的樣本中，有65例培養(yǎng)陰性（9.9%，65／656），38例培養(yǎng)污染（5.8%，38／656），分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性并進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌（MTB）與非結(jié)核分枝桿菌（NTM）分群鑒別553例，21例菌種鑒定結(jié)果為NTM（3.8%，21／553），最后獲得可用于分析藥敏結(jié)果者532例。在進(jìn)行基因芯片檢測(cè)的標(biāo)本中，有未檢測(cè)到MTB40例（6.1%，40／656），無(wú)法判讀結(jié)果10例（1.5%，10／656），NTM 21例（3.5%，21／606），總計(jì)獲得可用于分析基因芯片結(jié)果者585例。綜合培養(yǎng)藥敏結(jié)果和基因芯片結(jié)果，最終有525例患者的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行利福平和異煙肼的藥物敏感性比較。

2.2 菌種鑒定檢測(cè)結(jié)果

兩種方法分別檢出NTM 21例，以培養(yǎng)法為參考方法，菌種鑒定的符合率為100%。21例NTM中，胞內(nèi)分枝桿菌5例、鳥分枝桿菌2例、龜分枝桿菌和膿腫分枝桿菌3例、戈登分枝桿菌2例、偶然分枝桿菌1例、不產(chǎn)色分枝桿菌3例、堪薩斯分枝桿菌1例、淺黃分枝桿菌3例、金色分枝桿菌1例，菌種分布達(dá)9種。

2.3 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基因芯片可同時(shí)檢測(cè)MTB對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性。

利福平的耐藥性檢測(cè)結(jié)果：525例患者有496例基因芯片法與培養(yǎng)法結(jié)果一致。以培養(yǎng)法為參考方法，基因芯片法的符合率為94.5%，敏感度為87.8%；特異度為96.0%。敏感度和特異度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.154，P＝0.695），見表1。

表1 基因芯片法和培養(yǎng)法檢測(cè)利福平藥物敏感性比較

異煙肼耐的藥性檢測(cè)結(jié)果：525例患者有470例基因芯片法與培養(yǎng)法結(jié)果一致。以培養(yǎng)法為參考方法，基因芯片法的符合率為89.5%，敏感度為81.9%，特異度為91.7%。敏感度和特異度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.899，P＝0.343），見表2。

表2 基因芯片法和培養(yǎng)法檢測(cè)異煙肼藥物敏感性比較

3 討論

BACTEC MGIT 960系統(tǒng)是目前最為理想的快速M(fèi)TB培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn)檢測(cè)系統(tǒng)［7］，較傳統(tǒng)方法縮短了報(bào)告時(shí)間，但確診仍需14－28天［8］，大大影響了臨床的時(shí)效性和易用性，導(dǎo)致了治療的不準(zhǔn)確和經(jīng)驗(yàn)性用藥，因此篩選快速、經(jīng)濟(jì)、適用性強(qiáng)的技術(shù)進(jìn)行結(jié)核菌及藥敏的常規(guī)檢測(cè)，對(duì)早期指導(dǎo)臨床選擇藥物、制定治療方案有重要意義。近年來(lái)NTM感染呈上升趨勢(shì)，據(jù)全國(guó)流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，NTM在分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本中的比例由1990年的4.9%增加至2000年的11.1%［9］，2010年增至22.9%［10］。NTM與MTB同屬抗酸桿菌，且臨床特征相似，故極易誤診誤治［11］，而NTM對(duì)常規(guī)抗結(jié)核藥具有較高的耐藥性［12－13］，因此，一個(gè)有效的方法就是分離鑒定出NTM菌種。本文656例抗酸染色涂片陽(yáng)性的患者中，培養(yǎng)法和基因芯片法各檢出非結(jié)核分枝桿菌21例，符合率100%，與何莉等［14］報(bào)道的95.8%接近，說(shuō)明基因芯片技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地篩選出非結(jié)核分枝桿菌，將大多數(shù)分枝桿菌鑒定到種，對(duì)結(jié)核病的確診有較大幫助。

MTB的耐藥性檢測(cè)是結(jié)核病治療的關(guān)鍵，主要有表型檢測(cè)法和基因型檢測(cè)法兩大類。隨著近年來(lái)新的實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)不斷出現(xiàn)，基因型檢測(cè)法越來(lái)越多的應(yīng)用于結(jié)核的藥物敏感實(shí)驗(yàn)［7］。目前商品化的基因型藥敏檢測(cè)技術(shù)主要有GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)、結(jié)核分枝桿菌線性探針技術(shù)及基因芯片技術(shù)等。有文獻(xiàn)報(bào)道［15］，以上方法檢測(cè)利福平耐藥性或者利福平和異煙肼的耐藥性均有較高的敏感度和特異度，但GeneXpert系統(tǒng)只能檢測(cè)利福平一種藥物的耐藥性，結(jié)核分枝桿菌線性探針技術(shù)不能進(jìn)行分枝桿菌的菌種鑒定，因而在結(jié)核病的快速診療方面，基因芯片技術(shù)具有更大的優(yōu)勢(shì)。本文基因芯片法對(duì)利福平的敏感度87.8%（86／98），特異度96.0%（410／427），與培養(yǎng)法符合率94.5%（496／525），Kappa值0.84，P＞0.05；對(duì)異煙肼的敏感度81.9%（96／116），特異度91.7%（375／409），與培養(yǎng)法符合率89.5%（470／525），Kappa值0.71，P＞0.05；兩種藥物藥敏結(jié)果總符合率為92.0%（966／1050）；與劉厚明等［16］研究結(jié)果較為接近，說(shuō)明MTB耐藥性檢測(cè)基因芯片法和培養(yǎng)法結(jié)果高度一致，基因芯片法能準(zhǔn)確地檢測(cè)MTB對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性。

綜上所述，基因芯片技術(shù)檢測(cè)分枝桿菌以及MTB對(duì)利福平和異煙肼耐藥性方面具有較高的敏感度和特異度，與傳統(tǒng)方法比較，具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，是一種值得推廣的更高效、更快捷、更安全的結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，在結(jié)核病的快速診療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

［1］蘇麗萍，連素琴，李向國(guó)，等.武威市結(jié)核病患者膳食多樣化水平及營(yíng)養(yǎng)素?cái)z入狀況調(diào)查［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（33）：6566.

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［9］全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25（1）：3.

［10］全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告［J］.中國(guó)防癆雜志，2012，34：485.

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Application evaluation of Gene chip technology in the identification of Mycobacterium species and determination of anti－tu－berculosis drug resistance

LI Xiao－fei1，2，LIANG Gui－liang2，PU Dong2，et al.（1.Department of Biomedical Engineering，Basic Medical College of Wuhan University，Wuhan，Hubei 430071，China；2.Department of clinical laboratory，The third people＇sHospital of Kunming，Kunming，Yunnan 650000，China）

ObjectiveStudy on the application value of rapid diagnosis and treatment of tuberculosis with Gene chip technology.MethodsMycobacterium species of sputum specimens of tuberculosis（positive acid fast stain）were identified by Gene chip technology and were cultured by BACTEC MGIT 960.Detection of tuberculosis？positive samples resistance to rifampin and isoniazid using Gene chip technology and culture method with BACTEC MGIT 960.Culture method with BACTEC MGIT 960was used as the reference method，Evaluation of the sensitivity，specificity，coincidence rate and the consistency of two methods of Gene chip technology in the identification of Mycobacterium species and drug resistance detection，Results21non－tuberculosis Mycobacterium were detected by the two methods in 656 patients with the smear－positive tuberculosis，the coincidence rate was 100%.The sensitivity was 87.8%（86／98），the specificity was96.0%（410／427），the coincidence rate was 94.5%（496／525），Kappa value 0.84in the gene－chip detecting rifaman－resistance Mycobacterium tuberculosis.The sensitivity was 81.9%（96／116），the specificity was 91.7%（375／409），the coincidence rate was 89.5%（470／525），Kappa value 0.71in the gene－chip detecting isoniazid－resistance Mycobacterium tuberculosis.ConclusionGene chip technology is an effective method for accurate screening of non－tuberculosis Mycobacterium.Gene chip technology and culture method with BACTEC MGIT 960had a high coincidence rate and high consistence in the two methods detecting rifaman－resistance and isoniazid－resistance Mycobacterium tuberculosis.Gene chip technology has wide application prospect in diagnosis and treatment of tuberculosis patients，as it allows fast and accuracy detection of the resistance to Rifampin and Isoniazi in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates.

Gene chip；Mycobacterium；Tuberculosis；Detection；Coincidence rate；Rifampin；Isoniazid

李曉非（1971－），女，本科，主任技師，從事傳染病原檢測(cè)方面的研究；趙旻（1972－），男，博士學(xué)歷，副研究員，腫瘤和病毒性疾病的分子機(jī)制方面的研究。

2014－03－09）

1007－4287（2015）02－0204－04

＊通訊作者

Q789

A