鄺志斌

炙甘草湯對(duì)慢性病毒性心肌炎小鼠病理?yè)p傷的影響

鄺志斌

目的 研究炙甘草湯影響慢性病毒性心肌炎小鼠病理?yè)p傷發(fā)生的情況。方法 將60只小鼠隨機(jī)分為兩組, 對(duì)照組和炙甘草湯組, 每組30只, 利用HE染色法對(duì)小鼠心肌病理形態(tài)進(jìn)行觀察, VG染色法對(duì)小鼠心肌組織膠原形態(tài)進(jìn)行觀察, 同時(shí)檢測(cè)了小鼠心肌組織的細(xì)胞光密度和面積。結(jié)果 炙甘草湯可以抑制小鼠發(fā)生慢性病毒性的心肌炎癥反應(yīng), 并減輕了小鼠的心肌組織的膠原增生情況, 炙甘草湯組小鼠心肌細(xì)胞光密度和面積均顯著高于對(duì)照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 炙甘草湯能有效地減輕小鼠發(fā)生慢性病毒性心肌炎小鼠發(fā)生病理性損傷。

慢性病毒性心肌炎；炙甘草湯；病理?yè)p傷

慢性病毒性心肌炎這一病癥嚴(yán)重危害到人類的健康, 目前慢性病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確, 臨床上一般要求對(duì)癥治療為主, 但是至今仍無(wú)針對(duì)性的特效治療方法［1］。所以, 如何防治慢性病毒性心肌炎的發(fā)生仍然是心血管內(nèi)科的難點(diǎn)和熱點(diǎn)課題［2］。本文通過對(duì)慢性病毒性心肌炎小鼠進(jìn)行炙甘草湯治療, 觀察小鼠的心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化, 初步探討小鼠的慢性病毒性心肌炎可能作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)小鼠60只, 雌雄各30只,4～5周的周齡,分籠飼養(yǎng), 飼養(yǎng)條件溫度和濕度正常滿足小鼠的生長(zhǎng)條件。

實(shí)驗(yàn)儀器包括超薄切片機(jī)(強(qiáng)生上海器材有限公司, 中國(guó))、光學(xué)顯微鏡(Olymapas, 日本)、MIA彩色病理圖像分析系統(tǒng)(Motic公司, 美國(guó))。

實(shí)驗(yàn)病毒柯薩奇CVB3m, 利用Hela細(xì)胞傳代［3］。

實(shí)驗(yàn)藥物與試劑有煎劑的炙甘草湯水, 由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供, 主要藥物成分是阿膠、生姜、大棗、人參、桂枝、麻仁、生地、麥門冬、炙甘草等, 取炙甘草湯浸膏, 用聚酰胺和732型陽(yáng)離子樹脂除去陽(yáng)離子和鞣質(zhì),再調(diào)pH值為7.0左右, 配制藥物最終濃度為生藥4 g/ml。其他藥劑還包括Van Gieson染液、伊紅溶液、蘇木素、多聚甲醛等［4］。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 將60只小鼠隨機(jī)分為兩組, 即空白對(duì)照組和炙甘草湯, 每組30只。炙甘草湯組于實(shí)驗(yàn)的第1、7、14、21天給予腹腔注射RMl640稀釋的CVB3m, 每次注射病毒量為0.1 ml10-3TCIDS0 CVB3m, 空白對(duì)照組于相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)給予同體積的RMl640。然后在在末次病毒注射后第7天開始給藥灌胃, 其中對(duì)炙甘草湯組需要予炙甘草湯水煎劑灌胃, 用量為1 ml；空白對(duì)照組灌以1 ml的蒸餾水。1次/d,連續(xù)4周。

1.2.2 標(biāo)本的采集與檢測(cè) 將處理后的小鼠頸椎脫臼后處死, 將小鼠前胸備皮, 消毒, 開胸, 取出心臟, 于4℃條件預(yù)冷生理鹽水沖洗血污, 隨后用濾紙吸干, 放置固定于4%多聚甲醛溶液中。隨后用HE染色法和VG染色法對(duì)小鼠的心肌組織進(jìn)行染色［5］。

1.2.3 檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞凋亡 檢測(cè)方法是應(yīng)用DNA原位缺口末端標(biāo)記法, 首先對(duì)組織進(jìn)行石蠟組織切片, 再經(jīng)過常規(guī)的脫蠟脫水處理后, 用蛋白酶K(Roche, USA)在室溫條件下孵育30 min后, 使用PBS緩沖液洗干凈切片后, 將切片放于含有甲醇的0.3%過氧化氫溶液在室溫條件下去孵育30 min,使用PBS緩沖液沖洗2次, 然后加入TUNEL反應(yīng)混合液在濕盒中37℃條件下孵育60 min, 使用PBS緩沖液沖洗3次,使用蘇木精復(fù)染, 梯度乙醇脫水透明, 最后使用中性樹膠封片。每張石蠟切片于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察, 計(jì)數(shù)呈棕黃色的TLNEL陽(yáng)性細(xì)胞核以及所有細(xì)胞核。心肌細(xì)胞凋亡情況以圖像分析系統(tǒng)(Motic Images Aovancel3.2)檢測(cè)的心肌細(xì)胞的平均光密度和總面積［6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SA.8.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別小鼠心肌組織HE染色結(jié)果 對(duì)照組的30只小鼠心肌組織通過HE染色發(fā)現(xiàn)其纖維排列整齊, 間質(zhì)血管無(wú)改變, 未見心肌細(xì)胞變性、壞死。炙甘草湯組小鼠心肌組織通過HE染色發(fā)現(xiàn)其纖維排列紊亂較輕教, 血管充血出血,少量炎細(xì)胞浸潤(rùn), 未見心肌斷裂, 間質(zhì)纖維化程度較為輕微。

2.2 不同組別小鼠心肌組織VG染色結(jié)果 對(duì)照組小鼠心肌組織通過VG染色發(fā)現(xiàn)其組織被染成紅色的極纖細(xì)的膠原纖維, 而且膠原纖維覆蓋面積大。炙甘草湯組小鼠的心肌組織通過VG染色發(fā)現(xiàn)其組織附近有少量的膠原纖維。說(shuō)明病毒感染了小鼠的心肌組織, 可以發(fā)現(xiàn)部分膠原結(jié)締組織發(fā)生增生, 還發(fā)生了間質(zhì)纖維化現(xiàn)象。通過圖像分析系統(tǒng)計(jì)算兩組的膠原容積發(fā)現(xiàn)炙甘草湯組的心肌膠原容積分?jǐn)?shù)要高于對(duì)照組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 不同組別小鼠心肌細(xì)胞凋亡的變化 炙甘草湯組小鼠心肌細(xì)胞光密度達(dá)到0.334, 顯著高于對(duì)照組的小鼠心肌光密度0.304, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；炙甘草湯組小鼠心肌細(xì)胞面積達(dá)到6.486, 顯著高于對(duì)照組的小鼠心肌面積4.259, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見表1。

表1 不同組別小鼠心肌細(xì)胞光密度和面積的變化 (±s)

表1 不同組別小鼠心肌細(xì)胞光密度和面積的變化 (±s)

注：兩組比較, P<0.05

對(duì)照組0.304±0.1144.259±0.241炙甘草湯組0.334±0.1276.486±0.589

3 討論

根據(jù)中國(guó)的中醫(yī)古籍記載, 是沒有“慢性病毒恤心肌炎”這一病名的, 臨床上根據(jù)其發(fā)病表現(xiàn), 可歸類于“痰飲”、“喘證”、“水腫”、“心悸”等病證。大多數(shù)醫(yī)家的經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為慢性病毒性心肌炎的主要發(fā)病機(jī)理為氣陰兩型, 所以在臨床多上此病的治療大多采用具有通陽(yáng)復(fù)脈和益氣養(yǎng)陰功效的炙甘草湯進(jìn)行治療。藥方中重用生地黃滋陰養(yǎng)血, 麥冬、阿膠、麻仁滋心陰, 養(yǎng)心血, 充血脈, 配伍炙人參、甘草、大棗益心氣,補(bǔ)脾氣, 佐以桂枝, 生姜辛涵心陽(yáng), 行溫通, 通血脈；諸藥合用, 使陰陽(yáng)調(diào)和, 氣血充足, 則脈結(jié)代、心動(dòng)悸, 皆得其平［7］。

在收到病毒感染后1個(gè)月的小鼠心肌病理改變顯示有不同程度的炎性病變, 病變部位炎癥細(xì)胞浸潤(rùn), 最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死。本研究中, 而與對(duì)照組相比, 炙甘草湯組的病理形態(tài)學(xué)通過HE染色法和VG染色法均觀察到心肌組織的病理變化較輕, 炙甘草湯組小鼠心肌細(xì)胞光密度和面積均顯著高于對(duì)照組。

綜上所述, 炙甘草湯能有效地防治慢性病毒性心肌炎,但是具體的防治作用機(jī)制尚有待于下一步工作的繼續(xù)研究。

［1］ 王麗慧.病毒性心肌炎的中醫(yī)藥治療進(jìn)展.云南中醫(yī)中藥雜志,2012,33(9):76-78.

［2］ 黎萍, 劉曉燕.病毒性心肌炎發(fā)病機(jī)制及輔助檢查研究進(jìn)展.心血管病學(xué)展,2012,3(4):515-517.

［3］ 寇秀靜, 葉鴻瑁, 吳相攸.病毒性心肌炎患兒細(xì)胞免疫狀況的研究.中華兒科雜志,2000,38(2):76.

［4］ 郝梓旭, 王中男.病毒性心肌炎的現(xiàn)代治療手段研究近況.吉林中醫(yī)藥,2007,27(5):66-67.

［5］ 王馳.炙甘草湯加味治療室性早搏40 例.浙江中醫(yī)雜志,1999,34(2):62.

［6］ 劉玉秀, 姚晨, 陳峰, 等.非劣效性/等效性試驗(yàn)中的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,2000,16(6):448-452.

［7］ 陳會(huì)君, 田源, 胡妮娜.炙甘草湯對(duì)慢性病毒性心肌炎小鼠心肌組織ADAMTS-1 的影響.中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)(旬刊),2012(z2).596-598.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.11.183

2015-02-06］

519100 遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院心血管內(nèi)科